芒果細菌性角斑病菌內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆與表達分析

姚全勝 楊倩 柳鳳 詹儒林

摘? 要：由柑橘黃單胞菌芒果致病變種（Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae， Xcm）引起的芒果細菌性角斑病是芒果上的一種重要的細菌性病害。利用同源基因克隆技術(shù)克隆了Xcm上內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase）基因CEL的全長，經(jīng)測序后運用多種生物信息學軟件對其序列進行分析。結(jié)果表明：CEL基因的完整閱讀框包含1134 bp，編碼377個氨基酸;預測分子量為40.72 kDa;等電點為9.01;不穩(wěn)定指數(shù)39.93，為穩(wěn)定蛋白;親水性為–0.081，有信號肽;總磷酸化位點有51個，無跨膜螺旋;在二級結(jié)構(gòu)預測中，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸結(jié)構(gòu)分別為35.28%、6.10%、16.45%和42.18%。經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域預測，具有Cellulase保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，該基因的氨基酸序列與X. citri pv. punicae str. LMG 859（CCF67690.1）的親緣關(guān)系最近。以gyrB、GAPHD和rpoD作為內(nèi)參基因，經(jīng)qRT-PCR分析CEL在Xcm侵染芒果葉片12 h后表達量持續(xù)上升，明顯高于對照，在72 h處為最大表達量，由此推斷該基因在病菌侵染時發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：芒果;細菌性角斑病;內(nèi)切葡聚糖酶;克隆;序列分析

中圖分類號：S435? ? ? 文獻標識碼：A

Cloning and Expression Analysis of Endo-1，4-β-D-glucanase Gene of Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae

YAO Quansheng， YANG Qian， LIU Feng*， ZHAN Rulin

South Subropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory for Post-harvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products of Hainan Province， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： Mango bacterial black spot which is caused by Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae is one of the most important bacterial diseases in mango. In this study， the CEL gene from Xcm was cloned using the homologous cloning method， the biochemical feature， tertiary structure and phosphorylation sites of the CEL protein were predicted by a variety of bioinformatics softwares. The results showed that the total length of cDNA was 1134 bp， encoding 377 amino acid polypeptides. The molecular weight of the protein was 40.72 kDa， the theoretical isoelectric point was 9.01， the instability index was 39.93， which was a stable protein， the hydrophilicity was –0.081， and there was a signal peptide in the endoglucanase. The total phosphorylation sites were 51， with no transmembrane helix. In the secondary structure prediction， the α - helix， β - corner， irregular curl and extended structure was 35.28%， 6.10%， 16.45% and 42.18%， respectively. According to the prediction of conservative domain， it had cellular conservative domains. Phylogenetic analysis showed that CEL gene had the closest genetic relationship with X. citri pv. punicae str. LMG 859 （CCF67690.1）. Using gyrB， GAPHD and rpoD as internal reference genes， quantitative real-time PCR analysis revealed that CEL expression was increasingly higher with the Xcm infecting mango leaves after 12 hours. The maximum expression was at 72 hours， which suggested that the gene played an important role in the infection of Xcm.

Keywords： mango; Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae; endoglucanase; cloning; sequence analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.022

植物細胞壁是植物體抵御各種逆境（生物脅迫和非生物脅迫）和正常生存的第一道防線，同時也是生物因子侵染植物體與植物相互斗爭的重要場所。細胞壁降解酶作為病原菌重要的致病因子，其主要功能是降解植物細胞壁，降解的物質(zhì)既可為病原菌提供營養(yǎng)物質(zhì)，使其順利在植物體內(nèi)定殖、繁殖和擴散，又能破壞植物的細胞壁導致寄主植物細胞分離和組織潰爛死亡[1-3]。芒果細菌性角斑病是由柑橘黃單胞菌芒果致病變種引起的一種細菌性病害，危害芒果的葉片、枝條、花芽、花和果實。發(fā)病初期在病斑位置形成水漬狀小點，進而擴大變成黑褐色多角型裂口，病斑的表面稍隆起，周圍常有黃色的暈圈。從病害的癥狀可看出，病菌在侵染的過程中細胞壁降解酶起重要作用。本實驗室前期采用3，5-二硝基水楊酸法測定了病原菌在侵染芒果的過程中細胞壁降解酶活性變化，產(chǎn)生6種主要細胞壁降解酶，其中β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶活性較高，多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶次之，果膠甲基轉(zhuǎn)移消除酶和多聚半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移消除酶較低，由此推測細胞壁降解酶是病原菌的一個重要致病因子[4]。為進一步了解病原菌產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶在病原菌侵染過程中的作用，本研究通過同源基因克隆技術(shù)，克隆病菌編碼的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶的CEL基因，分析CEL基因的序列特征，并將獲得的氨基酸序列與已獲得的其他黃單胞菌的CEL蛋白序列相比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析CEL基因的親緣性。通過qRT-PCR方法，對CEL基因在侵染芒果葉片時的表達情況進行分析，以期從細胞壁降解酶的水平探索病原菌的致病機理。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試菌株：供試病原菌編號為Xcm003，由本實驗室分離自典型芒果細菌性角斑病癥狀的芒果果實，具有強致病力，經(jīng)形態(tài)學觀察、生理生化測定及全基因組序列分析鑒定為柑橘黃單胞菌芒果致病變種Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae[5]。供試引物：根據(jù)NCBI上公布的CEL基因序列，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計特異性引物，序列如下：CEL1：5-ATGTCCGCTGTCTGTTTTTC-3，CEL2：5-TCAGCGTGTCGTGCGTGCAA-3，引物序列委托天一輝遠生物有限公司進行合成。

1.2? 方法

1.2.1? CEL基因的擴增和克隆? 使用天根細菌基因組DNA試劑盒提取Xcm003菌株DNA，以DNA為模板，PCR擴增反應體系：Taq-Plus PCR Forest Mix（2×） 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板1 μL，DMSO 1.0 μL，補充ddH2O至總體積為25 μL。反應條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)40次;72 ℃延伸10 min;16 ℃保存。用1.5%的凝膠進行電泳檢測，將目的條帶進行切膠回收，連接pEASY-T1 Cloning Vector上并熱擊轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細胞中，用載體上的通用引物M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer鑒定陽性克隆，將陽性克隆菌株送至天一輝遠生物有限公司進行測序。

1.2.2? CEL基因的生物信息學分析? 將拼接和去除載體序列后的CEL基因序列用DNAMAN軟件進行氨基酸推導，將推導的氨基酸序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上用Protein BLAST進行同源序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析。利用在線Expasy數(shù)據(jù)庫（http：//www.expasy.org/）、NetPhos3.1（http：//www.mybiosoftware.com/）和SignalP 4.1（http：//www.cns.dtu.dk/services/SignalP/）軟件預測蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)。利用在線SOPMA（https：/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/）、Phyre2（http：//www. sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）和PyMOL（https：//pymol. org/2/）對蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)進行預測。選取與Xcm003同源性高的其他菌株的蛋白，用MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建進化樹，采用5000次重復抽樣評估。

1.2.3? CEL基因的表達分析? 以gyrB、GAPHD和rpoD同時作為內(nèi)參基因，以cDNA基因全長設(shè)計RT-PCR引物，F(xiàn)：CTGTGTCAGCAGCACCAT TG和R：CCAGCCACACATCTGCATTG。將健康無病芒果嫩葉，清洗干凈后采用刺傷接種法在葉片背面接種病原菌，每個傷口吸取50 μL的菌液，覆蓋傷口表面;于28 ℃，100%濕度保存。接種3、6、12、24、48、72 h后，吸取葉片表面的菌液，清洗干凈后迅速冷凍，以未接種到芒果葉片的菌液為對照。采用TransZolTM UP Plus RNA Kit試劑盒提取RNA。利用TIANScriptⅡRT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄實驗。結(jié)合Ct值采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，利用Excel軟件制圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? CEL基因的擴增

以Xcm003菌株基因組DNA為模板，用特異引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，約在1100 bp處有一條明亮的擴增條帶，經(jīng)測序?qū)嶋H長度為1134 bp，與預期的目的條帶大小相符，該序列已提交至GenBank，登錄號為MK386677。

2.2? CEL基因的生物信息學分析

用DNAMAN軟件分析CEL基因序列，結(jié)果表明：CEL基因編碼的雙鏈核苷酸分子量為699.25 kDa，（G+C）摩爾分數(shù)為62.5%，（A+T）摩爾分數(shù)為37.4%，其中C的摩爾分數(shù)為34%。通過Protein BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因含有一個Cellulase保守結(jié)構(gòu)域和一個GH1超家族，與X. citri pv. mangiferaeindicae LMG 941菌株的endo-beta-1，4-glucanase B（CCG35265.1）基因的相似度為98%（圖1）。對CEL基因推導出的氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)CEL基因編碼377個氨基酸，理論分子量為40 720.94;理論等電點為9.01，負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）有25個，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）有30個，分子式：C1818H2793N503 O540S12，原子總數(shù)為5666;不穩(wěn)定系數(shù)是39.93，為穩(wěn)定性蛋白;脂肪系數(shù)為79.20，總平均親水性為–0.081;在第20位氨基酸處有最大疏水性位點，為2.722;在第333位氨基酸處有最小疏水性位點，為–2.722。

利用在線軟件預測CEL基因編碼蛋白序列中無跨膜結(jié)構(gòu)域，1～29位氨基酸為信號肽序列（圖2），為膜外蛋白。該蛋白共有51個磷酸位點，其中蘇氨酸（threonine）18個，酪氨酸（tyrosine）8個，絲氨酸（serine）25個。

該蛋白由α-螺旋（133AA，35.28%）、β-折疊（23AA，6.10%）、無規(guī)則卷曲（159AA，42.18%）和延伸結(jié)構(gòu)組成（圖3），該結(jié)構(gòu)是基于PDB數(shù)據(jù)庫中的c5hosA為模板，覆蓋率為83%，可信度為100%（Chain： A： PDB Molecule： cellulase;PDB Title：crystal structure of the endo-beta-1， 4-glucanase xac0029 from 2 X. axonopodis pv. citri，相似度為71%）。

2.3? CEL蛋白的系統(tǒng)進化分析

將CEL基因序列推導為氨基酸序列后經(jīng)protein Blast比對，挑取相似度高的不同菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，CEL蛋白與X. citri pv. mangiferaeindicae LMG 941（CCG35265.1）聚為一支，與Pseudomonas cissicol（OOW75189.1）、X. citri pv. punicae str. LMG 859（CCF67690.1）的進化水平接近，而與X. cannabis pv. phaseoli（KGK56529.1）和Xanthomonas sp. CFBP 7698（RJS02557.1）的較遠。

2.4? CEL基因的表達分析

CEL基因在病菌正常生長條件下（對照），表達處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，以rpoD、GAPHD和gyrB為內(nèi)參基因，0～72 h的相對表達量介于2.14～2.38之間，且無顯著差異（圖5）。在病原菌侵染芒果葉片過程中，雖然內(nèi)參基因rpoD、GAPHD和gyrB的表達量不同，但表達趨勢相同，葉片表面菌液的CEL基因相對表達量在0～12 h與對照相似，隨后表達量持續(xù)上升，72 h表達量最高。

3? 討論

β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶作為纖維素酶系之一，其主要作用在纖維素分子內(nèi)部非結(jié)晶區(qū)，通過水解β-1，4-糖苷鍵將長鏈的纖維素大分子截短，再與外切葡聚糖酶（又名纖維二糖水解酶，CBH）和β-葡聚糖苷酶（又名纖維二糖酶，BGL）協(xié)同作用將纖維素降解為葡萄糖，該降解途徑已在紡織、洗滌和造紙等領(lǐng)域中廣泛應用[6-8]。目前關(guān)于β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶的研究主要集中在2個方面，一是作用于植物細胞壁的一種纖維素水解酶，是降解天然纖維素的重要成員，用于資源再利用方面[9-10];二是作為植物病原菌的一種重要致病因子，通過降解寄主的細胞壁，破壞植物的形態(tài)、細胞功能，使病原菌能在寄主體內(nèi)繁殖和擴散，從而完成侵染過程[11-14]。高樹廣等[15]采用分光光度法，測定了離體條件下芝麻莖點枯病菌分泌的纖維素降解酶活性及變化趨勢，結(jié)果均能檢測到內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，表明這組纖維素酶系能降解芝麻秸稈纖維素，是其病菌的重要致病因子。肖羅等[16]采用RT-PCR和RACE方法從香蕉穿孔線蟲中獲得編碼β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因的cDNA序列，該cDNA序列全長1630 bp，包含1個1404 bp的開放閱讀框，編碼467個氨基酸，理論分子量與等電點分別為48.22 kDa和6.04。序列分析結(jié)果表明，該酶含有糖基水解酶家族5的保守結(jié)構(gòu)域，N端具有22個氨基酸殘基組成的信號肽，C端含有細菌式樣的纖維素結(jié)合域。本研究利用同源基因克隆技術(shù)克隆了芒果細菌性角斑病病原菌CEL基因的全長，經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，CEL基因的完整閱讀框包含1134 bp，編碼377個氨基酸;分子量為40.72 kDa，等電點為9.01，屬于穩(wěn)定蛋白，具有Cellulase保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，該基因的氨基酸序列與X. citri pv. punicae str. LMG 859（CCF67690.1）的親緣關(guān)系最近。qRT-PCR實驗結(jié)果表明，病菌在侵染芒果葉片時，CEL基因隨著接種時間的延長表達量持續(xù)增高，72 h表達量最高。從本研究結(jié)果還可看出，在接種病菌12 h內(nèi)，CEL基因的相對表達量與對照差別不大，推測病菌在侵染芒果葉片時，不同細胞壁降解酶在不同的時間發(fā)揮各自作用，CEL基因編碼的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶主要作用時間是在病菌與寄主接觸偏后期。因本研究離體葉片72 h后發(fā)生萎蔫，RNA提取受阻，沒有進一步監(jiān)測到CEL基因表達量的變化情況，因而CEL基因后續(xù)表達量的變化需要在芒果活體中檢測，但活體芒果受環(huán)境等多種因子的影響，結(jié)果不穩(wěn)定，因此摸清CEL基因表達的具體時效還需進一步探討。本研究獲得了芒果細菌性角斑病β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因，并研究該基因的表達情況，有助于了解病原菌致病基因的表達，后續(xù)研究將結(jié)合RNAi以及構(gòu)建表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，深入研究和驗證該基因的功能，從而為防治芒果細菌性角斑病提供新的策略。

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責任編輯：黃東杰