HPLC法測定貝林司他中有關物質的含量

孫朋杰 張莉 杜超 李偉 卓秋琪

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）08-0973-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.13

摘 要 目的：建立貝林司他中有關物質的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法檢測并以加校正因子的主成分自身對照法進行計算。以ODS-AM為色譜柱，以1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調節(jié)pH值至3.5）-乙腈（85 ∶ 15，V/V）為流動相A、1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調節(jié)pH值至3.5）-乙腈（30 ∶ 70，V/V）為流動相B進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為220 nm，進樣量為10 μL。結果：貝林司他及雜質A、D、F、G、H的線性范圍分別為0.113～1.693、0.050～1.496、0.117～1.750、0.098～1.471、0.120～1.799、0.100～1.506 μg/mL（r≥0.999 7），后5個雜質的校正因子分別為1.0、1.0、1.2、1.5、1.0;檢測限分別為0.250、0.590、0.490、0.600、0.500 ng，定量限分別為0.500、1.170、0.980、1.200、1.000 ng，回收率為90.18%～111.48%（RSD為1.52%～4.78%，n=9），穩(wěn)定性（100 h）、精密度試驗的RSD均不大于16%，耐用性良好。3批貝林司他原料藥中檢測出雜質A、D、H，含量分別為0.030%～0.038%、0.019%～0.022%、0.012%～0.013%，其他最大單體雜質含量為0.012%～0.013%，總雜質含量為0.075%～0.084%，未檢出雜質B、C、F、G。結論：成功建立了測定貝林司他中有關物質含量的方法，且方法準確、專屬性好。

關鍵詞 貝林司他;有關物質;高效液相色譜法;加校正因子的主成分自對照法

Content Determination of Related Substances in Belinostat by HPLC

SUN Pengjie1，ZHANG Li1，DU Chao1，2，LI Wei2，ZHUO Qiuqi1（1. Shenzhen Wanle Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shenzhen 518000， China; 2. School of Chemistry and Biological Engineer， Yichun University， Jiangxi Yichun 336000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for the content determination of related substances in belinstat. METHODS： HPLC method was adopted and the principal component self-control comparison method with correction factor was used to calculate the contents of related substances. The determination was performed on ODS-AM column with 1.02% potassium dihydrogen phosphate buffer （pH value adjusted to 3.5 with phosphoric acid）-acetonitrile （85 ∶ 15，V/V） as mobile phase A， 1.02% potassium dihydrogen phosphate? buffer （pH value adjusted to 3.5 with phosphoric acid）-acetonitrile （30 ∶ 70， V/V） as mobile phase B （gradient elution）， at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and the detection wavelength was 220 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of belinstat and impurities A， D， F， G， H were 0.113-1.693， 0.050-1.496， 0.117-1.750， 0.098-1.471， 0.120-1.799， 0.100-1.506 μg/mL （r≥0.999 7）. The correction factors of the last 5 impurities were 1.0， 1.0， 1.2， 1.5， 1.0; the detection limits were 0.250， 0.590， 0.490， 0.600， 0.500 ng， respectively. The quantification limits were 0.500， 1.170， 0.980， 1.200， 1.000 ng， respectively. The recoveries were 90.18%-111.48% （RSD=1.52%-4.78%， n=9）. RSDs of stability （100 h） and precision tests were no more than 16%， and the durability was good. Impurities A， D and H were detected in 3 batches of belinlestat， the contents were 0.030%-0.038%， 0.019%-0.022% and 0.012%-0.013%， respectively. The contents of other maximum monomer impurities were 0.012%-0.013% and the total impurities were 0.075%-0.084%. Impurities B， C，F， G were not detected. CONCLUSIONS： The method for the content determination of related substances in belinstat has been successfully established， and the method is accurate and specific.

KEYWORDS? ?Belinostat; Related substances; HPLC; Principal component self-control? comparison method with correction factor

貝林司他（結構式見圖1）是一種組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑，由美國Spectrum Technologies公司和丹麥TopoTarget公司聯(lián)合研發(fā)生產，主要用于治療復發(fā)性或難治性外周T細胞淋巴瘤（PTCL）[1-5]。貝林司他于2009年被授予孤兒藥地位，用于治療PTCL;2013年，貝林司他的PTCL二期臨床結果超過預期值，其新藥申請于2014年2月6日被美國FDA受理，并于2014年7月3日通過審批獲準上市。目前，在國內已有盛世泰科生物醫(yī)藥技術（蘇州）有限公司和石藥控股集團有限公司對其進行仿制藥臨床申報[6]。

臨床前體外藥效學研究顯示，貝林司他對各種HDAC的抑制作用較好，其不僅能夠提高組蛋白的乙?；剑€能夠促進細胞凋亡;更重要的是，貝林司他可優(yōu)先殺傷腫瘤細胞而非正常細胞，并可抑制納摩爾濃度HDAC的活性[7-11]。毒性研究顯示，貝林司他有一定的毒性，但是相對于該藥給復發(fā)性、難治性淋巴瘤患者帶來的臨床獲益，這些毒性反應是可以接受的[12-14]。此外，貝林司他用于治療卵巢癌、胸腺上皮癌、骨髓異常增生癥、惡性腹膜間皮瘤等其他腫瘤的二期臨床試驗研究結果均顯示，其具有較好的療效[14-17]。由此可見，貝林司他的臨床使用前景良好。

有關物質主要是在生產過程中帶入的起始原料、中間體、聚合體、副反應產物，以及貯藏過程中的降解產物等，其中生產過程中帶入的列為工藝雜質，貯藏過程中新增或含量出現增長的雜質列為降解雜質。有關物質是藥品質量研究的關鍵項目之一，其含量高低是反映藥品純度的直接指標。有研究指出，對藥品的純度要求，應基于安全性和生產實際情況兩方面的考慮[18]?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合嗌V法（HPLC）聯(lián)合加校正因子的主成分自身對照法針對貝林司他生產及貯藏中可能引入的7種雜質進行定性分析，考慮到雜質對照品的可獲得性僅對其中5種雜質進行定量分析，以期能將各雜質及主成分有效分離，并為貝林司他的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括e2695型HPLC儀（美國Waters公司）、XP205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

貝林司他原料藥（批號171201、180101、180102，純度≥99%）、雜質A對照品（批號140813，純度99.3%）、雜質B對照品（批號140810，純度99.5%）、雜質C對照品（批號140822，純度99.4%）、雜質D對照品（批號140801，純度99.9%）、雜質F對照品（批號140806，純度99.1%）、雜質G對照品（批號150416，純度99.5%）、雜質H對照品（批號140903，純度98.6%）均由深圳萬樂藥業(yè)有限公司提供;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以ODS-AM（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調節(jié)pH值至3.5）-乙腈（85 ∶ 15，V/V）為流動相A、1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調節(jié)pH值至3.5）-乙腈（30 ∶ 70，V/V）為流動相B進行梯度洗脫（洗脫程序見表1），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為220 nm，進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取貝林司他原料藥約50 mg，置于100 mL量瓶中，加流動相B溶解并定容，搖勻，制成質量濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液。

2.2.2 自身對照溶液 取“2.2.1”項下供試品溶液1 mL，置于1 000 mL量瓶，加流動相B稀釋并定容，搖勻，制成質量濃度為0.5 μg/mL的自身對照溶液。

2.2.3 雜質單一對照品溶液 取雜質A、B、C、D、F、G、H對照品適量，均用流動相B溶解、稀釋，搖勻，制成質量濃度均為0.5 mg/mL的單一對照品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性混合溶液 取“2.2.1”項下供試品溶液和“2.2.3”項下雜質A、B、C、D、F、G、H的單一對照品溶液各適量，用流動相B溶解、稀釋，搖勻，制成貝利司他質量濃度為0.5 mg/mL，雜質A、B、C、D、F、G、H質量濃度均為5 μg/mL的系統(tǒng)適用性混合溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取系統(tǒng)適用性混合溶液和空白溶液（流動相B）適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，雜質F、雜質B、貝林司他、雜質H、雜質D、雜質G、雜質C、雜質A的出峰時間依次為16.123、18.475、19.222、21.699、29.609、35.165、38.227、42.317 min;以貝林司他峰計，各峰的相對保留時間分別為0.84、0.96、1.00、1.13、1.54、1.83、1.99、2.20;分離度均大于1.5，理論板數均大于80 000;空白溶液對測定無干擾，詳見圖1。

2.4 破壞試驗

取貝林司他原料藥適量，分別進行高溫（100 ℃下放置48 h）、光照[（5 000±500）lx下放置45天]、酸（加2 mol/L鹽酸溶液2 mL，于60 ℃下加熱1.5 h）、堿（加2 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，于60 ℃下加熱1.5 h）、氧化（加5%H2O2溶液2 mL，于60 ℃下加熱6 h）破壞試驗，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液后，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并與未破壞的供試品溶液進行對比。結果表明，在不同的破壞條件下，貝林司他與各降解物均能有效分離，其中貝林司他對溫度、光照均較穩(wěn)定，對酸、堿、氧均較敏感，且其主要降解雜質均為雜質D，詳見圖2（以主成分為參照，根據相對保留時間判定各色譜峰的歸屬）。

2.5 線性關系和校正因子考察

精密稱取貝林司他原料藥和雜質A、D、F、G、H對照品各約10 mg，置于100 mL量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻;移取上述溶液5 mL，置于100 mL量瓶，加流動相B稀釋至刻度，得混合線性對照品貯備液。取貯備液適量，用流動相B稀釋至各雜質含量分別為主成分的0.02%、0.04%、0.08%、0.10%、0.12%、0.24%、0.30%，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，以主成分為參比物質計算校正因子（即主成分貝林司他的線性斜率/對應雜質的線性斜率）。貝林司他和5個雜質的線性關系及校正因子見表2。

2.6 檢測限與定量限考察

取“2.5”項下混合線性對照品貯備液以流動相B進行逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1分別計算檢測限和定量限。結果，雜質A、D、F、G、H的檢測限分別為0.250、0.590、0.490、0.600、0.500 ng，定量限分別為0.500、1.170、0.980、1.200、1.000 ng。

2.7 準確度試驗

取貝林司他原料藥適量，精密稱定，加入“2.5”項下混合線性對照品貯備液，制成對應單個雜質濃度為0.05%、0.10%、0.20%的樣品溶液，各配制3份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果，雜質A、D、F、G、H的回收率分別為99.21%～106.78%、95.01%～111.48%、100.19%～104.45%、90.18%～100.56%、95.03%～104.33%，RSD分別為2.37%、4.78%、1.52%、3.65%、3.86%（n=9），表明該方法的準確度良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下供試品溶液適量，分別在室溫（放置0、12、52、100 h）、冰箱冷藏（2～8 ℃，放置0、50、100 h）下保存，分別于上述時間點精密量取10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按加校正因子的主成分自身對照法計算含量。結果，主成分和總雜質含量基本穩(wěn)定，無新雜質出現;檢出雜質A、D、H，未檢出雜質B、C、F、G，提示供試品溶液在上述條件下放置100 h穩(wěn)定，詳見表3、表4。

2.9 精密度試驗

2.9.1 重復性 按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按加樣正因子的主成分自身對照法計算含量。結果，供試品溶液中只檢測出雜質A、D、H，未檢出雜質B、C、F、G，詳見表5。

2.9.2 中間精密度 分別由2名試驗人員于不同時間按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按加校正因子的主成分自身對照法計算含量。結果，供試品溶液中只檢測出雜質A、D、H，未檢出雜質B、C、F、G，詳見表6。

2.10 耐用性試驗

按“2.2.1”“2.2.2”項下方法制備供試品溶液和自身對照溶液，在“2.1”項下色譜條件基礎上，調整流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）、色譜柱[ODS-AM（250 mm×4.6 mm，5 μm），批號054、055、056]，分別進樣測定，記錄峰面積并按加樣正因子的主成分自身對照法計算含量。結果，在不同色譜條件下，雜質A、D、H含量變化值最大分別為0.002%、0.004%、0.002%，最大單雜含量變化值最大為0.002%，總雜質含量變化值最大為0.008%，雜質B、C、F、G均未檢出，詳見表7。

2.11 貝林司他原料藥中有關物質含量的測定

取3批貝林司他原料藥，按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按加校正因子的主成分自身對照法計算含量。結果，貝林司他樣品中只檢測出了雜質A、D、H，且含量均符合規(guī)定（本研究根據ICH指導原則[19]及本品實際生產情況，擬定最大單雜不得過0.1%），雜質B、C、F、G均未檢出，詳見表8。

3 討論

3.1 色譜條件的篩選

經筆者查詢，國內外藥典均無貝林司他有關物質檢查方法和含量測定方法的相關規(guī)定。本研究首先經過預實驗摸索擬定初步的色譜條件，之后根據所需要研究的雜質情況對色譜條件進行優(yōu)化。結果，所建方法不受空白溶劑的干擾，主峰與前后相鄰雜質分離度均大于1.5。

3.2 稀釋劑的選擇

貝林司他原料藥及雜質對照品在水中的溶解度均較差，在有機溶劑中的溶解度較好。為了減少樣品稀釋劑與流動相差異引起的基線波動，經預實驗發(fā)現，流動相B[1.02%磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.5）-乙腈（30 ∶ 70，V/V）]對貝林司他和雜質的溶解性均較好，且對其測定無干擾，因此選擇流動相B作為溶劑。

3.3 檢測波長的選擇

本研究預實驗發(fā)現，貝林司他及各雜質在220 nm波長附近均有較大吸收，因此選擇220 nm作為貝林司他有關物質的檢測波長。

綜上所述，本研究所建立的HPLC法能使貝林司他的主峰與雜質A、B、C、D、F、G、H得到良好分離。同時，破壞試驗結果顯示，貝林司他降解過程中質量基本穩(wěn)定，且主峰與各降解雜質均能達到良好分離。經檢驗，本研究中所使用的3批貝林司他原料藥中僅存在雜質A、D、H，且含量均較低，雜質B、C、F、G均未檢出。可見，本研究成功建立了測定貝林司他中有關物質含量的方法，且方法準確、專屬性好。

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（收稿日期：2020-12-29 修回日期：2021-03-30））

（編輯：鄒麗娟）