芒果苷對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖脂代謝的影響

黎梓霖 金惠杰 方佳 劉奕明 林愛(ài)華

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）09-1082-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.10

摘 要 目的：分析芒果苷（MGF）對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞（IR-HepG2細(xì)胞）糖脂代謝的影響，并探討潛在機(jī)制。方法：以人肝癌HepG2細(xì)胞為對(duì)象，以1 mmol/L棕櫚酸+2 mmol/L油酸聯(lián)合培養(yǎng)建立IR-HepG2細(xì)胞模型。以鹽酸二甲雙胍為陽(yáng)性對(duì)照，分別檢測(cè)低、中、高濃度MGF（125、250、500 μmol/L）作用24 h對(duì)IR-HepG2細(xì)胞中校正葡萄糖耗氧量和三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量的影響;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路上游關(guān)鍵因子脂聯(lián)素（APN）、脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）、APPL1、AMPK以及下游胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵因子胰島素受體底物1（IRS-1）、蛋白激酶B（Akt）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）mRNA的相對(duì)表達(dá)量;采用Western blot法檢測(cè)AMPK蛋白的磷酸化水平。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞校正葡萄糖消耗量和APN、AdipoR2、APPL1、AMPK、IRS-1、GLUT4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量以及AMPK蛋白磷酸化水平均顯著降低，TG、TC含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，各藥物組校正葡萄糖消耗量和APN（MGF中、高濃度組除外）、AdipoR2、APPL1、AMPK（MGF中、高濃度組除外）、IRS-1（MGF中、高濃度組除外）、Akt（陽(yáng)性對(duì)照組除外）、GLUT4（MGF高濃度組除外）mRNA的相對(duì)表達(dá)量以及AMPK蛋白磷酸化水平均顯著升高，TG、TC含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：芒果苷可能通過(guò)激活通路上游靶點(diǎn)APN，進(jìn)而調(diào)控AMPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，降低TG、TC含量，發(fā)揮改善胰島素抵抗及糖脂代謝異常狀態(tài)的作用。

關(guān)鍵詞 芒果苷;胰島素抵抗;人HepG2細(xì)胞;糖脂代謝;腺苷一磷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路;脂聯(lián)素

Effects of Mangiferin on Glucose and Lipid Metabolism of Insulin-resistant HepG2 Cells

LI Zilin1，JIN Huijie1，F(xiàn)ANG Jia1，LIU Yiming1，2，LIN Aihua3（1. Phase Ⅰ Clinical Trial Center， Guangdong Provincial Hospital of TCM/the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510120， China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Research on Traditional Chinese Medicine Syndrome， Guangdong Provincial Hospital of TCM/the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510120， China; 3. Dept. of Pharmacy， Guangdong Provincial Hospital of TCM/Zhuhai Hospital， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangdong Zhuhai 519000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To analyze the effects of mangiferin （MGF） on glucose and lipid metabolism in insulin resistance （IR） HepG2 cells， and to explore the potential mechanism. METHODS： Using human hepatoma HepG2 cells as research objects， 1 mmol/L palmitic acid and 2 mmol/L oleic acid were used to establish the IR-HepG2 cell model. Using metformin hydrochloride as positive control， the effects of low-concentration， medium-concentration and high-concentration MGF （125， 250， 500 μmol/L） on the corrected glucose consumption， the contents of triglyceride （TG） and total cholesterol （TC） in IR-HepG2 cells were detected. The mRNA expression of APN， AdipoR2， APPL1， AMPK in the upstream of AMPK signaling pathway and IRS-1， Akt and GLUT4 in the downstream insulin signaling pathway were detected by RT-PCR. The phosphorylation level of AMPK protein was detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with control group， corrected glucose consumption， mRNA expression of APN， AdipoR2， APPL1， AMPK， IRS-1 and GLUT4， as well as the phosphorylation level of AMPK protein were decreased significantly in model group， while the contents of TG and TC were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， corrected glucose consumption， mRNA expression of APN （except for MGF medium-concentration and high-concentration groups）， AdipoR2， APPL1， AMPK （except for MGF medium-concentration and high-concentration groups）， IRS-1（except for MGF medium-concentration and high-concentration groups）， Akt（except for positive control group）， GLUT4（except for MGF high-concentration group）were increased significantly in administration groups， while the contents of TG and TC were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Mangiferin may activate APN， which is the upstream target of pathway， and then regulate AMPK signaling pathway， so as to promote glucose uptake of IR-HepG2 cells， reduce TG and TC contents， and improve IR and abnormal glucose and lipid metabolism.

KEYWORDS ? Mangiferin; Insulin resistance; Human HepG2 cells; Glucose and lipid metabolism; AMPK signaling pathway; APN

2型糖尿?。═2DM）多由胰島素抵抗（IR）和B細(xì)胞功能障礙所致[1]，其中IR主要表現(xiàn)為肝臟、肌肉、脂肪等靶組織對(duì)胰島素的敏感性下降以及對(duì)葡萄糖的攝取及利用減少[2]。腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）分布于各組織中，其活化后能增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，改善IR和糖脂代謝紊亂，從而減輕T2DM相關(guān)癥狀[3]。有研究指出，脂聯(lián)素（APN）為AMPK信號(hào)通路的上游靶點(diǎn)，是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子，可通過(guò)與脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）結(jié)合而激活A(yù)MPK，而APPL1是AdipoR2與AMPK之間的關(guān)鍵銜接蛋白[4-5]。當(dāng)AMPK被激活后，AMPK可進(jìn)一步促進(jìn)下游胰島素信號(hào)通路中胰島素受體底物1（IRS-1）的磷酸化，激活蛋白激酶B（Akt）;Akt活化可促使細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，從而促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，最終改善IR[6]。

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖，其主要活性成分之一的芒果苷（MGF）具有改善IR和糖脂代謝紊亂的作用[7-8]，且這種作用與AMPK及其下游胰島素信號(hào)通路Akt和GLUT4的表達(dá)有關(guān)[9-10]。有研究表明，MGF能提升糖尿病IR模型大鼠血清中APN的含量[11]，但其是否能通過(guò)激活這一上游靶點(diǎn)進(jìn)而調(diào)控AMPK信號(hào)通路中的各關(guān)鍵因子的表達(dá)，尚有待進(jìn)一步探討?；诖?，本研究以HepG2肝臟細(xì)胞IR模型（即IR-HepG2細(xì)胞模型）為對(duì)象，初步探討了MGF對(duì)其糖脂代謝以及AMPK信號(hào)通路的影響，旨在為MGF改善T2DM患者IR的作用機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、Synergy H1型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）、HR40-ⅡA2型生物安全柜（廣州火元醫(yī)療器械有限公司）、AB135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Microfuge 16型臺(tái)式微量離心機(jī)和Allegra X-22R型多功能臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Bechman Coulter公司）、7500型熒光定量基因擴(kuò)增儀和Veriti型PCR逆轉(zhuǎn)錄儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）、KS260型控制型搖床（德國(guó)KIA公司）、Min-protean Tetra型垂直電泳系統(tǒng)和ChemiDocTM型高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

MGF對(duì)照品（批號(hào)MUST-17040103，純度98.21%）購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司;鹽酸二甲雙胍對(duì)照品（陽(yáng)性對(duì)照，批號(hào)100664-201805，純度98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)WXBC0994V，純度99%）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;MTT試劑（批號(hào)QR14912）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司;二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)RNBF2368）、棕櫚酸（PA，批號(hào)SLBW9894，純度98.5%）、油酸（OA，批號(hào)SLCC4023，純度99%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)8119081）、南美胎牛血清（批號(hào)2176398）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號(hào)15140122）、胰酶（批號(hào)2120649）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;葡萄糖氧化酶法檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20180801137）購(gòu)自南京建成生物工程研究所;三酰甘油（TG）試劑盒（批號(hào)E1003）、膽固醇（TC）試劑盒（批號(hào)E1005）均購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0010）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;彩色蛋白Marker（批號(hào)00784045）、5×十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（批號(hào)VG299802）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;TRIzol試劑（批號(hào)213506）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Fast Start Universal SYBR Green Master熒光定量試劑盒（批號(hào)04913914001）、Transcriptor cDNA Synth. Kit2反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)04897030001）均購(gòu)自瑞士Roche公司;10×RIPA裂解液（批號(hào)75）、兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)4970）、兔AMPK單克隆抗體（批號(hào)2603）、兔磷酸化AMPK（p-AMPK）單克隆抗體（批號(hào)2535）均購(gòu)自美國(guó)CST公司;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)SA00001-2）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司;ECL發(fā)光液（批號(hào)1939801）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;擴(kuò)增引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)、合成;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人源HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同），待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%左右時(shí)，用含0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化并傳代至新的培養(yǎng)皿中。

2.2 MGF藥液和新鮮培養(yǎng)基的配制

精密稱取MGF對(duì)照品適量，溶于DMSO中，制得濃度為250 mmol/L的MGF母液，分裝。臨用前，將上述母液用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

取PA、OA適量，加水于75 ℃溶解后，趁熱與20%無(wú)脂肪酸BSA[以pH為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解]混勻并濾過(guò)。臨用前，用完全培養(yǎng)基稀釋成含3%BSA、1 mmol/L PA、2 mmol/L OA的新鮮培養(yǎng)基。

2.3 細(xì)胞分組與IR模型建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞適量，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（鹽酸二甲雙胍5 mmol/L，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[12]并結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果）和MGF高、中、低劑量組（500、250、125 μmol/L，劑量設(shè)置參考本課題組前期研究結(jié)果），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。除正常組加入含3%BSA的完全培養(yǎng)基外，其余各組細(xì)胞均參照文獻(xiàn)[13]加入“2.2”項(xiàng)下新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)建立IR模型。建模后，正常組、模型組和各藥物組分別替換為不含或含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 細(xì)胞葡萄糖消耗量檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞適量，以3×104個(gè)/孔接種于96孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥，同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞的空白對(duì)照組。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，取上清液，參照葡萄糖氧化酶法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的葡萄糖含量并計(jì)算葡萄糖消耗量：葡萄糖消耗量=空白對(duì)照組葡萄糖含量-待測(cè)組葡萄糖含量。棄去上清液后，各組細(xì)胞加入0.5 mg/mL的MTT試劑適量，于室溫下反應(yīng)10 min，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力=（待測(cè)組細(xì)胞OD值-空白對(duì)照組OD值）/（正常組OD值-空白對(duì)照組OD值）?；谏鲜銎咸烟窍牧亢图?xì)胞活力計(jì)算校正葡萄糖消耗量：校正葡萄糖消耗量=葡萄糖消耗量/細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞中TG、TC含量檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞適量，以1.2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液充分混勻，靜置10 min。收集各組細(xì)胞裂解液，于70 ℃加熱10 min，以2 000 r/min離心5 min，取上清液，參照相應(yīng)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞中TG、TC含量;同時(shí)，采用BCA法測(cè)定各孔的蛋白濃度，用于校正TG、TC含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞中AMPK信號(hào)通路各關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)AMPK信號(hào)通路上游關(guān)鍵因子APN、AdipoR2、APPL1、AMPK以及下游胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵因子IRS-1、Akt、GLUT4的mRNA表達(dá)情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞適量，以1.2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，細(xì)胞經(jīng)TRIzol法提取總RNA并根據(jù)Transcriptor cDNA Synth. Kit2試劑盒說(shuō)明書(shū)方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，參照Fast Start Universal SYBR Green Master試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR擴(kuò)增體系，混勻后，使用熒光定量基因擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共20 μL）包括：cDNA模板2 μL，2×SYBR Green Ⅰ Master 10 μL，上、下游引物（其引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1）各0.5 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法以QuantStudio 7 RT-PCR System（Version 1.1）軟件計(jì)算各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果均以正常組為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞適量，以1.2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA裂解液充分裂解，收集裂解液，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度測(cè)定結(jié)果，加入5×SDS PAGE蛋白上樣緩沖液適量，于100 ℃煮沸變性10 min。取變性蛋白，進(jìn)行10%SDS-PAGE分離后，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，經(jīng)5%BSA室溫封閉1 h;加入p-AMPK、AMPK一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000）和β-actin一抗（稀釋比例為1 ∶ 2 000），于4 ℃孵育過(guò)夜;用TBST溶液清洗10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗10 min×3次，經(jīng)ECL發(fā)光液顯色后，使用高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀曝光成像。采用Image Lab 5.2.1軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析，以p-AMPK與AMPK條帶灰度值的比值（即p-AMPK/AMPK比值）表示后者的磷酸化水平，結(jié)果均以正常組為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Graph Pad Prism 7.0軟件作圖。數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)（方差齊）或Dunnetts T3檢驗(yàn)（方差不齊）。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MGF對(duì)IR-HepG2細(xì)胞糖代謝的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞的校正葡萄糖消耗量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組細(xì)胞的校正葡萄糖消耗量均顯著升高（P<0.01），詳見(jiàn)表2。

3.2 MGF對(duì)IR-HepG2細(xì)胞脂代謝的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組細(xì)胞內(nèi)上述指標(biāo)含量均顯著降低（P<0.01），詳見(jiàn)表2。

3.3 MGF對(duì)IR-HepG2細(xì)胞AMPK信號(hào)通路上游關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞APN、AdipoR2、APPL1、AMPK mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和MGF低劑量組細(xì)胞APN、AMPK mRNA以及各藥物組AdipoR2、? ? ?APPL1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)表3。

3.4 MGF對(duì)IR-HepG2細(xì)胞AMPK下游胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞中IRS-1、GLUT4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和MGF低劑量組細(xì)胞中IRS-1 mRNA，MGF各劑量組Akt mRNA，以及陽(yáng)性對(duì)照組和MGF低、中劑量組GLUT4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)表4。

3.5 MGF對(duì)IR-HepG2細(xì)胞AMPK蛋白磷酸化水平的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞AMPK蛋白磷酸化水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組細(xì)胞AMPK蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)圖1、表5。

4 討論

T2DM是一種慢性代謝性疾病，被認(rèn)為是全世界第五大死亡原因，其主要表現(xiàn)是患者糖脂代謝紊亂[14]。IR是T2DM發(fā)生的重要因素，其主要特征是胰島素作用的靶組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用減少[2]。肝臟作為胰島素作用的主要靶組織，是維持糖脂代謝穩(wěn)定的重要器官[2]。HepG2細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞，由其構(gòu)建的IR細(xì)胞模型是學(xué)界公認(rèn)的可用于研究IR發(fā)生機(jī)制和降糖藥物作用機(jī)制的理想模型[15]，故本研究參考文獻(xiàn)[13]采用1 mmol/L PA+2 mmol/L OA聯(lián)合培養(yǎng)建立IR細(xì)胞模型。

本課題組前期研究表明，以DMSO作為溶劑，MGF最大溶解濃度為250 mmol/L，DMSO體積分?jǐn)?shù)在0.2%（即500 μmol/L）以下對(duì)細(xì)胞毒性影響小;此外與正常組比較，MGF高、中、低劑量（500、250、125 μmol/L）對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率均無(wú)顯著影響，且細(xì)胞存活率均在90%以上，故本研究選擇上述3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，MGF高、中、低劑量均可顯著提高IR-HepG2細(xì)胞的校正葡萄糖消耗量，其中以高劑量作用效果相對(duì)最強(qiáng);同時(shí)，其還可顯著降低IR-HepG2細(xì)胞中TG、TC的含量，提示MGF可調(diào)整IR-HepG2細(xì)胞的糖脂代謝異常。值得注意的是，經(jīng)MGF干預(yù)后，各劑量組細(xì)胞TG含量無(wú)明顯的劑量依賴趨勢(shì)，且從具體數(shù)據(jù)上看，MGF低劑量下調(diào)TG含量的效果較明顯。有研究指出，APN可降低肝臟組織中TG的含量并上調(diào)胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示TG含量與APN的表達(dá)水平有關(guān)[16]。經(jīng)藥物干預(yù)后，MGF低劑量組細(xì)胞內(nèi)APN mRNA的相對(duì)表達(dá)量更高，這可能是低劑量組細(xì)胞內(nèi)TG含量更低的原因。

AMPK是一種細(xì)胞內(nèi)能量感受器和調(diào)節(jié)因子，已被證明與IR、肝臟脂肪病變、糖尿病腎病及糖尿病心肌病的發(fā)生密切相關(guān)[17-19]。p-AMPK是AMPK的磷酸化形式，p-AMPK/AMPK比值能反映AMPK的活化程度;AMPK磷酸化的增加可有助于AMPK信號(hào)通路的激活，從而有利于抗IR作用的發(fā)揮[4]。有研究表明，MGF對(duì)糖脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用與AMPK信號(hào)通路有關(guān)，但MGF不是該通路的直接激活劑，提示該化合物介導(dǎo)的AMPK激活可能與其上游關(guān)鍵因子有關(guān)[18-21]。APN是AMPK信號(hào)通路的上游靶點(diǎn)，其水平升高對(duì)T2DM、IR具有明顯的改善作用[16，22]。研究表明，APN缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠腦組織IR、認(rèn)知功能減退和老年癡呆癥樣病變[23];另有研究表明，總APN水平與T2DM心血管風(fēng)險(xiǎn)有密切關(guān)聯(lián)[24]?？梢?jiàn)，APN可以改善IR、增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。因此，研究MGF是否通過(guò)APN調(diào)節(jié)AMPK信號(hào)通路以改善糖脂代謝紊亂有重要意義。有研究指出，AdipoR2與IR相關(guān)的肝功能異常有關(guān)[25];此外，初診T2DM患者血清中APPL1水平異常升高，提示AdipoR2和APPL1均可能參與了T2DM的發(fā)生發(fā)展[26]。APPL1作為AdipoR2與AMPK之間的關(guān)鍵銜接蛋白，其表達(dá)量與APN介導(dǎo)AMPK磷酸化呈正相關(guān)[27]?；罨腁MPK可激活下游胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)糖脂代謝，最終改善IR[7]。IRS-1主要存在于胰島素敏感組織中，是介導(dǎo)胰島素及其功能的關(guān)鍵信號(hào)蛋白[28]。有研究表明，IRS-1與T2DM患者IR之間存在相關(guān)性，該因子異常表達(dá)可導(dǎo)致IR的發(fā)生，而IR又是T2DM的重要病理機(jī)制[29-30]。Akt是葡萄糖代謝中的關(guān)鍵酶，其可被胰島素激活，介導(dǎo)胰島素刺激的多種生物學(xué)效應(yīng)[31]。GLUT4作為骨骼肌和脂肪細(xì)胞中的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是Akt下游調(diào)控葡萄糖攝取的重要因子，可在胰島素的刺激下將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胰島素敏感組織中以促進(jìn)胰島素的利用，從而維持血糖的穩(wěn)定和細(xì)胞正常的生理功能[32]?；诖耍狙芯繉?duì)上述AMPK信號(hào)通路上、下游關(guān)鍵因子mRNA的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，采用1 mmol/L PA聯(lián)合2 mmol/L OA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞，可導(dǎo)致IR的發(fā)生，并顯著下調(diào)AMPK信號(hào)通路中關(guān)鍵因子APN、AdipoR2、APPL1、IRS-1、GLUT4 mRNA的表達(dá)，以及AMPK蛋白的磷酸化水平，而不會(huì)顯著影響Akt mRNA的表達(dá)。經(jīng)MGF干預(yù)24 h后，各藥物組細(xì)胞中上述關(guān)鍵因子的表達(dá)均不同程度地上調(diào)，其中APN、APPL1、AMPK、IRS-1、Akt、GLUT4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量以及p-AMPK/AMPK比值均以低或低、中劑量組最優(yōu);而MGF各劑量組細(xì)胞中AdipoR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量并無(wú)明顯的量效關(guān)系，且均與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)。有研究指出，AMPK為“細(xì)胞能量感受器”，細(xì)胞的能量狀況決定著AMPK的活化程度：APN會(huì)促進(jìn)細(xì)胞腺苷三磷酸（ATP）的消耗，使細(xì)胞內(nèi)ATP的含量降低、腺苷一磷酸的含量升高，可使AMPK通路被活化，以參與細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)[33]。相比于MGF高劑量組，MGF中、低劑量組細(xì)胞的校正葡萄糖消耗量相對(duì)較小，即能量攝入相對(duì)小，此時(shí)可能起到反饋調(diào)節(jié)作用，使得對(duì)應(yīng)組細(xì)胞中APN的表達(dá)水平相對(duì)較高，提示此時(shí)AMPK通路被活化的可能性較高，從而增加了細(xì)胞內(nèi)AMPK及其信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA的表達(dá)。

綜上所述，MGF可能通過(guò)激活通路上游靶點(diǎn)APN，進(jìn)而調(diào)控AMPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，降低細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量，發(fā)揮改善細(xì)胞IR及糖脂代謝異常狀態(tài)的作用。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] ZHENG Y，LEY S H，HU F B. Global aetiology and epidemiology of type 2 diabetes mellitus and its complications[J]. Nat Rev Endocrinol，2018，14（2）：88-98.

[ 2 ] DAS P，BISWAS S，MUKHERJEE S，et al. Association of oxidative stress and obesity with insulin resistance in type 2 diabetes mellitus[J]. Mymensingh Med J，2016，25（1）：148-152.

[ 3 ] DESJARDINS E M，STEINBERG G R. Emerging role of AMPK in brown and beige adipose tissue （BAT）：implications for obesity，insulin resistance，and type 2 diabetes[J]. Curr Diab Rep，2018，18（10）：80.

[ 4 ] YAN J，WANG C，JIN Y，et al. Catalpol ameliorates hepa- tic insulin resistance in type 2 diabetes through acting on AMPK/NOX4/PI3K/Akt pathway[J]. Pharmacol Res，2018，130：466-480.

[ 5 ] JI R，XU X，XIANG X，et al. Regulation of adiponectin on lipid metabolism in large yellow croaker （Larimichthys crocea）[J]. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol? Lipids，2020，1865（5）：158711.

[ 6 ] ARIAS E B，CARTEE G D. In vitro simulation of calorie restriction-induced decline in glucose and insulin leads to increased insulin-stimulated glucose transport in rat skeletal muscle[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，293（6）：E1782-E1788.

[ 7 ] LIM S M，JEONG J J，CHOI H S，et al. Mangiferin corrects the imbalance of Th17/Treg cells in mice with? ? ? TNBS-induced colitis[J]. Int Immunopharmacol，2016，34：220-228.

[ 8 ] DU S，LIU H，LEI T，et al. Mangiferin：an effective therapeutic agent against several disorders：review[J]. Mol Med Rep，2018，18（6）：4775-4786.

[ 9 ] GIR?N M D，SEVILLANO N，SALTO R，et al. Salacia oblonga extract increases glucose transporter 4-mediated glucose uptake in L6 rat myotubes：role of mangiferin[J]. Clin Nutr，2009，28（5）：565-574.

[10] SEKAR V，MANI S，MALARVIZHI R，et al. Antidiabetic effect of mangiferin in combination with oral hypoglycemic agents metformin and gliclazide[J]. Phytomedicine，2019，59：152901.

[11] SALEH S，EL-MARAGHY N，REDA E，et al. Modulation of diabetes and dyslipidemia in diabetic insulin-resistant rats by mangiferin：role of adiponectin and TNF-α[J]. An Acad Bras Cienc，2014，86（4）：1935-1948.

[12] ZHU X，YAN H，XIA M，et al. Metformin attenuates triglyceride accumulation in HepG2 cells through decrea- sing stearyl-coenzyme A desaturase 1 expression[J]. Lipids Health Dis，2018，17（1）：114.

[13] 金惠杰，邱昆成，李嘉華，等.藥對(duì)知母-黃柏對(duì)胰島素抵抗的改善作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2019，35（7）：1020- 1024.

[14] ZHENG T，SHU G，YANG Z，et al. Antidiabetic effect of total saponins from Entada phaseoloides （L.） Merr. in type 2 diabetic rats[J]. J Ethnopharmacol，2012，139（3）：814-821.

[15] LI L，LI G，WEI H，et al. The endoplasmic reticulum stress response is associated with insulin resistance-me-? diated drug resistance in HepG2 cells[J]. Neoplasma，2015，62（2）：180-190.

[16] YADAV A，KATARIA M A，SAINI V，et al. Role of leptin and adiponectin in insulin resistance[J]. Clin Chim Acta，2013，18：80-84.

[17] DASKALOPOULOS E P，DUFEYS C，BERTRAND L，et al. AMPK in cardiac fibrosis and repair：actions beyond metabolic regulation[J]. J Mol Cell Cardiol，2016，91：188-200.

[18] CHELLAPPAN D K，YAP W S，BT AHMAD SUHAIMI N A，et al. Current therapies and targets for type 2 diabetes mellitus[J]. Panminerva Med，2018，60（3）：117-131.

[19] DZIUBAK A，W?JCICKA G，WOJTAK A，et al. Metabo- lic effects of metformin in the failing heart[J]. Int J Mol Sci，2018，19（10）：2869.

[20] ZHANG Y，LIU X，HAN L，et al. Regulation of lipid and glucose homeostasis by mango tree leaf extract is media- ted by AMPK and PI3K/AKT signaling pathways[J]. Food Chem，2013，141（3）：2896-2905.

[21] LI J，LIU M，YU H，et al. Mangiferin improves hepatic li- pid metabolism mainly through its metabolite-norathyriol by modulating SIRT-1/AMPK/SREBP-1c signaling[J]. Front Pharmacol，2018，9：201.

[22] KRAUSE M P，MILNE K J，HAWKE T J. Adiponectin- consideration for its role in skeletal muscle health[J]. Int J Mol Sci，2019，20（7）：1528.

[23] NG RC，CHENG OY，JIAN M，et al. Chronic adiponectin deficiency leads to Alzheimers disease-like cognitive impairments and pathologies through AMPK inactivation and cerebral insulin resistance in aged mice[J]. Mol Neurodegener，2016，2016，11（1）：71.

[24] LIAN K，GUO X，HUANG Q，et al. Reduction levels and the effects of high-molecular-weight adiponectin via AMPK/eNOS in Chinese type 2 diabetes[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes，2016，124（9）：541-547.

[25] L?PEZ-BERMEJO A，BOTAS-CERVERO P，ORTEGA- DELGADO F，et al. Association of ADIPOR2 with liver function tests in type 2 diabetic subjects[J]. Obesity （Silver Spring），2008，16（10）：2308-2313.

[26] WANG Y，ZHANG M，YAN L，et al. Serum APPL1 level is elevated in newly diagnosed cases of type 2 diabetes mellitus[J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2012，32（9）：1373-1376.

[27] YANAI H，YOSHIDA H. Beneficial effects of adiponectin on glucose and lipid metabolism and atherosclerotic progressio，2019，20（5）：1190.

[28] BOUCHER J，KLEINRIDDERS A，KAHN C R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol，2014，6（1）：a009191.

[29] TIAN S，JIA W，LU M，et al. Dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A ameliorates insulin resistance in neurons by up-regulating IRS-1 expression[J]. J Biol Chem，2019，294（52）：20164-20176.

[30] REHMAN K，AKASH M S H，LIAQAT A，et al. Role of interleukin-6 in development of insulin resistance and type 2 diabetes mellitus[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2017，27（3）：229-236.

[31] CAO Y，SUN W. Fuzhu jiangtang granules combined with metformin reduces insulin-resistance in skeletal muscle of diabetic rats via PI3K/Akt signaling[J]. Pharm Biol，2019，57（1）：660-668.

[32] KONG D，SONG G，WANG C，et al. Overexpression of mitofusin 2 improves translocation of glucose transporter 4 in skeletal muscle of highfat dietfed rats through AMPactivated protein kinase signaling[J]. Mol Med Rep，2013，8（1）：205-210.

[33] 孫維琦，王路紅，李環(huán). AMPK細(xì)胞能量感受器研究進(jìn)展[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，18（2）：213- 216.

（收稿日期：2020-11-05 修回日期：2021-02-25）

（編輯：張?jiān)拢?/p>