固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析環(huán)境水樣中5種酚類化合物

劉友彬，李玉陽(yáng)，李燕*

(1. 濟(jì)南大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2. 山東省化工研究院，山東 濟(jì)南 250014)

作為重要的高分子化工原料，酚類化合物(雙酚類和烷基酚類)廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。在我們的日常環(huán)境中，酚類化合物會(huì)以微量或者痕量的水平存在，其理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，不易降解，因此會(huì)在環(huán)境中長(zhǎng)期存在，產(chǎn)生潛在的危害風(fēng)險(xiǎn)，并通過(guò)食物鏈等各種途徑污染環(huán)境水源等介質(zhì)，最后進(jìn)入人體，影響人體代謝生理平衡，進(jìn)一步引發(fā)疾病[1-2]。因此建立環(huán)境水樣中此類物質(zhì)的分析測(cè)定方法，對(duì)考察環(huán)境水體中酚類化合物的含量及保護(hù)人類健康有重要的意義。

目前，報(bào)道較多的關(guān)于此類物質(zhì)的測(cè)定方法有氣相色譜法[3]、液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜法[6]、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等。氣相色譜和液相色譜分析時(shí)間較長(zhǎng)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定雙酚類物質(zhì)需要衍生化步驟，過(guò)程較為繁瑣；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是利用液相色譜作為質(zhì)譜進(jìn)樣系統(tǒng)，使復(fù)雜的化學(xué)組分得到分離，再利用質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行定量分析，準(zhǔn)確性和靈敏度優(yōu)勢(shì)明顯；毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法主要用于單種酚類物質(zhì)的分析。高效液相可以縮短色譜分離時(shí)間，和質(zhì)譜法聯(lián)用進(jìn)一步提高了準(zhǔn)確性和快捷性。環(huán)境水樣中酚類化合物含量較低，會(huì)增加樣品的檢測(cè)難度，再者就是樣品基體會(huì)比較復(fù)雜，可能存在一些干擾，也會(huì)影響樣品的萃取效果，所以對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理顯得格外重要。

目前關(guān)于酚類化合物的樣品前處理技術(shù)主要有液-液萃取、分散液-液萃取、微波輔助提取萃取、固相萃取、基質(zhì)輔助固相萃取、快速萃取試劑盒等。固相萃取(solid-phase extraction, SPE)是使用固定相吸附劑對(duì)液體樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行萃取，從而使目標(biāo)物脫離樣品的基體和干擾物，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和富集目標(biāo)物的目的[7]。作為一種重要的前處理手段，有著操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速及便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和環(huán)境等領(lǐng)域。

目前很多方法主要集中在對(duì)單個(gè)雙酚類物質(zhì)的測(cè)定，同時(shí)測(cè)定水中多種雙酚類化合物的報(bào)道較為少見(jiàn)。本文以環(huán)境水體為研究對(duì)象，分別對(duì)固相萃取條件(pH、樣品流速、洗脫劑種類、洗脫劑用量)、質(zhì)譜條件(質(zhì)譜離子源、監(jiān)測(cè)反應(yīng)模式)、色譜條件(流動(dòng)相的比例)進(jìn)行優(yōu)化，建立了全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法可同時(shí)分析5種酚類化合物，即雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、雙酚S(BPS)、n-壬基酚(NP)、n-辛基酚(OP)。本方法可為環(huán)境水中酚類化合物的定性定量分析提供技術(shù)保障，亦可為其他樣品中酚類化合物分析提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

超高液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent 1260+6460B QQQ)；固相萃取儀(Dionex SPE-280)；氮吹濃縮儀(Biotage)；超純水制備儀(Millipore Milli-Q Integral15)；色譜柱Thermoforms C18(2.6 μm, 2.1 mm×100 mm) (Thermoforms)。

BPA(標(biāo)準(zhǔn)品，純度不低于99.9%)； BPF(標(biāo)準(zhǔn)品，純度不低于99.9%)； BPS(標(biāo)準(zhǔn)品，純度不低于99.9%)； NP(標(biāo)準(zhǔn)品，純度不低于99.9%)； OP(標(biāo)準(zhǔn)品，純度不低于99.9%)；乙腈(色譜純)；乙酸銨(分析純)。

1.2 樣品的采集與保存

樣品采集根據(jù)《水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)》[8]要求的方法操作，用4 L棕色玻璃瓶采集每個(gè)點(diǎn)位的樣品。樣品須在4 ℃冰箱冷藏保存，并在24 h內(nèi)進(jìn)行分析測(cè)試。

1.3 樣品前處理

預(yù)先用6 mL甲醇，達(dá)到去干擾和活化固相萃取柱(Waters, cc 500 mg)的目的，再用6 mL純水通過(guò)小柱條件化。采集1000 mL水樣，加入硫酸調(diào)節(jié)pH為6左右，以10 mL/min流速通過(guò)活化的固相萃取柱，完成固相萃取富集。加入10 mL純水，然后抽空氣30 min，加入10 mL二氯甲烷/乙腈洗脫，將洗脫液氮吹干，用1 mL乙腈/水定容，待測(cè)。

1.4 儀器條件

圖1 酚類化合物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of phenolic compounds

質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件：采用電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)模式采用多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。毛細(xì)管電壓為4.0 kV，離子源溫度為500 ℃，氣簾氣(CUR)壓力為40 psi(1 psi=6895 Pa)，噴霧針電壓為-4500 V，噴霧氣(GS1)壓力為55 psi，碰撞氣(CAD) 壓力為Medium，目標(biāo)掃描時(shí)間為0.1 s，入口電壓(EP)為10 V，出口電壓(CXP)為13 V，脫溶劑溫度350 ℃，氮?dú)饬魉?80 L/h。各化合物的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1 酚類化合物的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件優(yōu)化

為了得到最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，分別對(duì)萃取條件如pH、樣品流速、洗脫劑種類、洗脫劑用量進(jìn)行探討和優(yōu)化。用樣品的回收率來(lái)表征實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，其計(jì)算如下式：

(1)

pH是影響樣品萃取效率的重要參數(shù)之一，pH的大小與水樣中化合物的存在狀態(tài)有很大關(guān)系。我們考察了樣品的pH分別為2、4、6、8、10時(shí)，對(duì)酚類化學(xué)物萃取效率的影響，見(jiàn)圖2。當(dāng)pH為2～6時(shí)樣品的回收率逐漸增大，當(dāng)pH=6時(shí)，可以看出5種酚類化合物的回收率最高；當(dāng)pH為6～10時(shí)，樣品的回收率逐漸降低?？梢?jiàn)pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響樣品的回收率，因此，選擇pH為6作為最佳的pH條件。

圖2 pH對(duì)酚類化合物萃取效率的影響Fig.2 Effect of pH on extraction efficiency of phenolic compounds

樣品流速的大小是考察固相萃取過(guò)程中目標(biāo)物能否有效富集的重要因素，實(shí)驗(yàn)研究了樣品流速在2、4、6、8、10 mL/min時(shí)的萃取效果。由圖3可以看出，當(dāng)流速在2～6 mL/min時(shí)，樣品的回收率隨著流速的增大而提高。當(dāng)流速在6～10 mL/min時(shí)，回收率隨樣品流速增加而降低?？赡芰魉龠^(guò)大，不能保證樣品的目標(biāo)物在固定相匯總從而有效保留。為了達(dá)到更好的萃取效果，采用6 mL/min作為最佳樣品流速。

圖3 樣品流速對(duì)酚類化合物萃取效率的影響Fig.3 Effect of sample flow rate on the extraction efficiency of phenolic compounds

作為影響固相萃取效果的重要參數(shù)，洗脫液的種類在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過(guò)程中也是必不可少的。當(dāng)把兩種不同的極性物質(zhì)放在一起時(shí)，除了各自分子間存在著取向力外，兩種不同分子間還存在著取向力，因此兩種不同的極性物質(zhì)可以相互混溶，即“相似相溶”原理。我們考察了常用的有機(jī)溶劑，包括甲醇(1)、乙腈(2)、丙酮(3)、甲醇/二氯甲烷(4)和乙腈/二氯甲烷(5)5種溶液作為洗脫液的萃取效果，由圖4可以看出，乙腈/二氯甲烷的洗脫能力明顯高于其他4種洗脫液。因此，選擇乙腈/二氯甲烷作為本實(shí)驗(yàn)的洗脫液。

圖4 洗脫劑種類對(duì)酚類化合物萃取效率的影響Fig.4 Effect of eluent type on the extraction efficiency of phenolic compounds

洗脫劑的用量同樣會(huì)影響SPE的效率，考察了洗脫劑用量在2、4、6、8、10 mL時(shí)的萃取效果，見(jiàn)圖5。在2～6 mL范圍內(nèi)，隨著洗脫劑用量的增加而增加。當(dāng)洗脫劑的用量繼續(xù)增大時(shí)，回收率基本不變。因此，選擇6 mL洗脫劑作為最佳洗脫劑用量。

圖5 洗脫劑用量對(duì)酚類化合物萃取效率的影響Fig.5 Effect of eluent content on the extraction efficiency of phenolic compounds

2.2 色譜條件的優(yōu)化

液相色譜分析中，流動(dòng)相的組成不僅影響目標(biāo)物的色譜峰型和分離效果，且直接影響檢測(cè)器的響應(yīng)值和檢測(cè)靈敏度?？疾炝艘译?水、甲醇-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨4種流動(dòng)相體系對(duì)5種化合物的分離效果。以信號(hào)響應(yīng)值、峰型和干擾程度作為評(píng)價(jià)效果的依據(jù)。與甲醇-水相比，甲醇-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-5 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相時(shí)，待測(cè)物的響應(yīng)值更高，提高了待測(cè)組分分離度。與乙腈-水相比，乙腈-5 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)同一標(biāo)樣，各化合物的回收率在85%～115%，可以看出在該流動(dòng)相下的目標(biāo)物的離子化效果更好; 5種化合物的色譜峰均沒(méi)有拖尾或者前展寬的現(xiàn)象，峰型更好；靈敏度更高。主要原因是由于甲醇和目標(biāo)酚類間存在一定的氫鍵作用，所以色譜圖存在不同程度的拖尾現(xiàn)象，乙酸銨的加入改善了這種拖尾現(xiàn)象，而目標(biāo)物在乙腈存在的條件下可以提高信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度。因此，采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括監(jiān)測(cè)離子模式、定量和定向離子選擇及儀器參數(shù)的設(shè)置。優(yōu)化質(zhì)譜條件的目的是為了找出保留時(shí)間和分析物峰之間的最佳分辨率，使樣品中每種物質(zhì)的離子化效率達(dá)到最佳。采用負(fù)離子模式測(cè)定酚類化合物時(shí)，因?yàn)槊糠N化合物自身帶有羥基，容易去質(zhì)子化，形成負(fù)離子峰，因此選用負(fù)離子模式定量檢測(cè)。用針泵進(jìn)樣100 μg/L的BPF、BPS、BPA、NP和OP的混合溶液，在負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式和分子離子峰。根據(jù)目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)，選取ESI作為電離源。實(shí)驗(yàn)中，以5種物質(zhì)的分子離子為基礎(chǔ)，采用子離子掃描方式選擇最優(yōu)的兩特征離子確定化合物的定量離子和定性離子，并優(yōu)化碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)使子離子的強(qiáng)度最大。配制5種物質(zhì)的混標(biāo)，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式優(yōu)化霧化氣(GS1)、輔助氣(GS2)、氣簾氣(CUR)、碰撞氣(CAD)、離子源電壓(IS)、離子化溫度(TEM)等質(zhì)譜參數(shù)(表2)，使樣品中每種物質(zhì)的離子化效率達(dá)到最佳。根據(jù)母離子與豐度高、干擾小的兩個(gè)子離子形成的離子對(duì)分別進(jìn)行定性、定量分析。

表2 酚類化合物的質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

2.4 方法建立

本方法使用外標(biāo)法定量。用初始流動(dòng)相稀釋并配制濃度分別為1、5、10、25、50、100、250、500 μg/L BPA、BPS、BPF、NP和OP標(biāo)準(zhǔn)系列。按照濃度從小到大的順序，依次上機(jī)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制，進(jìn)一步得出線性方程和回歸系數(shù)。通過(guò)重復(fù)7次空白實(shí)驗(yàn)計(jì)算得各組分最低檢測(cè)濃度，依據(jù)HJ168—2010[9]要求計(jì)算最低檢出限和方法定量限，得出方法定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，5種酚類化合物在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)范圍為0.997 9～0.999 7，滿足定量分析的需求。

表3 各目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限

選擇一種類型已知且目標(biāo)物未檢出的環(huán)境水樣(如地下水)進(jìn)行前處理。對(duì)每類水樣分別選取高、中、低3個(gè)濃度進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，按全程序經(jīng)固相萃取富集后測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定5次，計(jì)算不同濃度水平樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、加標(biāo)回收率等參數(shù)。由表4可以看出，方法的精密度在2.54%～7.88%，回收率在89.40%～104.20%，說(shuō)明該方法可行。

表4 各目標(biāo)物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率(n=5)

和已有文獻(xiàn)中酚類化合物檢測(cè)方法比較，結(jié)果如表5所示。本文方法使用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用，提高了目標(biāo)物的靈敏度。該方法檢出限更低，精密度良好，回收率較好，準(zhǔn)確度高，另外分析時(shí)間(5 min)較短，節(jié)約了儀器測(cè)試時(shí)間。上述結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的方法適用于水中多種酚類化合物的分析。

表5 環(huán)境水樣中酚類化合物檢測(cè)方法對(duì)比

2.5 樣品分析

采集4種類型的環(huán)境水樣進(jìn)行實(shí)際樣品分析，按全程序經(jīng)固相萃取富集后測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定5次，其中地表水樣品色譜圖見(jiàn)圖6(a)，BPA處的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6(b)。由表6可以得出，地表水檢出BPA含量為1.06 ng/L，其余樣品中均未檢出目標(biāo)物。

圖6 地表水樣品色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.6 MRM chromatogram and MS of surface water

表6 環(huán)境水樣中各目標(biāo)物的分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

本文建立了環(huán)境水樣中5種酚類化合物的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。5種酚類化合物的檢出限為0.05～0.15 ng/L，定量限為0.20～0.65 ng/L，方法的精密度在2.54%～7.88%，回收率在89.40%～104.2%。該方法準(zhǔn)確可靠，可以為環(huán)境水樣中酚類化合物的污染特征和分布規(guī)律研究提供相應(yīng)的方法依據(jù)，也可以為后續(xù)國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。