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    氨基酸分析儀法快速檢測土鱉蟲中谷氨酸含量

    2021-06-10 06:55:40張華麗周洪亮孫家昌
    山東科學 2021年3期
    關(guān)鍵詞:土鱉蟲谷氨酸分析儀

    張華麗,周洪亮 ,孫家昌

    (1.濟寧醫(yī)學院 山東省出生缺陷研究與轉(zhuǎn)化協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 濟寧 272067; 2.濟寧市婦幼保健計劃生育服務中心,山東 濟寧 272000)

    土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉 (EupolyphagasinensisWalker)或冀地鱉(Steleophagaplancyia(Boleny))的雌蟲干燥體[1],又稱土鱉、簸箕蟲、地鱉蟲、地烏龜、土元等[2]。土鱉蟲在我國《神農(nóng)本草經(jīng)》等各種古代醫(yī)藥學典籍中均有詳細記載,其性寒味咸,有活血散瘀、消腫止痛、接骨連筋之功效,可用于淤血癥、跌打損傷、慢性肝炎等[3-4]。現(xiàn)代藥理學研究證明,土鱉蟲有抗凝血和抗血栓、肝臟保護[5]、提高免疫力[6]、抗氧化、抗衰老[7]、抗腫瘤[8-9]、促進骨骼愈合[10]等作用,作為傳統(tǒng)的藥食兩用資源,具有良好的開發(fā)前景。

    土鱉蟲中富含多種氨基酸,總質(zhì)量分數(shù)占蟲體的40%[11-13],其游離和水解氨基酸包含了17種以上主要氨基酸,其中7種是人體所必需的氨基酸,占其氨基酸總量的30%以上[14],其中以谷氨酸、丙氨酸及酪氨酸含量最高,在活血化瘀、消腫止痛、抗氧化等方面發(fā)揮著重要的藥理作用[15-16]。近年來對土鱉蟲中氨基酸的研究主要集中在藥理活性方面,如何準確并快速地檢測土鱉蟲中的氨基酸含量,對其質(zhì)量控制及開發(fā)應用具有重要的現(xiàn)實意義。

    氨基酸含量測定方法較多,包括可見分光光度法[17]、氣質(zhì)聯(lián)用儀技術(shù)[18]、柱前衍生化高效液相色譜法和氨基酸自動分析儀法[19]等??梢姺止夤舛确ㄖ荒軠y定總氨基酸含量,氣質(zhì)聯(lián)用儀技術(shù)前處理步驟復雜,柱前衍生化高效液相色譜法存在衍生化試劑不穩(wěn)定、衍生化反應受溶液pH影響大等缺點。而氨基酸分析儀法有選擇性、專屬性強,靈敏度高,檢測速度快等優(yōu)點,操作簡便,適用于多種組分中單一組分的快速檢測分析,因而本研究以谷氨酸為指標性成分,采用氨基酸自動分析儀,優(yōu)化土鱉蟲中谷氨酸的提取檢測方法,為其質(zhì)量控制及資源深入開發(fā)提供技術(shù)支持。

    1 儀器與材料

    1.1 實驗儀器

    DFT-200手提式小型粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司);L-8900氨基酸分析儀(日立公司);SHZ-DIII循環(huán)水真空泵(鄭州予華儀器制造有限公司);204E/02電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司);GZX-9023MBZ電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)。

    1.2 實驗材料

    谷氨酸標準液(日本和光純藥株式會社);鹽酸溶液(萊陽經(jīng)濟開發(fā)區(qū)精細化工廠);重蒸水(自制)。土鱉蟲購自中藥店(10批次樣品產(chǎn)地見表1),60 ℃干燥至恒重,粉碎,過40目篩,細粉備用。

    表1 土鱉蟲樣品來源

    2 方法與結(jié)果

    2.1 供試品溶液的制備

    精密稱取土鱉蟲粉末50 mg,將其粉碎,置于安瓿內(nèi),加入6 mol/L的鹽酸20 mL密封,恒溫100 ℃水解22 h,將水解產(chǎn)物置于蒸發(fā)皿中蒸干,加入7~8 mL蒸餾水,再蒸干,重復3次。加入0.2 g活性炭脫色,過濾水洗至澄清。稀釋至50 mL 后,用氨基酸自動分析儀測定含量。

    2.2 對照品溶液的制備

    取谷氨酸標準液(2.5 μmol/mL)2 mL稀釋至50 mL,作為標樣對照液(0.1 μmol/mL)。

    2.3 標準曲線的繪制

    精密移取谷氨酸標準液(2.5 μmol/mL)10、15、30、60、120 μL于5個樣品管中,稀釋至1200 μL,配置成濃度分別為0.020 83、0.031 25、0.062 50、0.125 0、0.250 0 μmol/mL的標準溶液。氨基酸分析儀自動依次進樣,進樣量為20 μL。以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標做回歸曲線,得回歸方程為Y=29 999 644X+84 962,R2=0.999 9,線性關(guān)系良好。

    2.4 鹽酸濃度對氨基酸提取的影響

    精密稱取4份過40目篩的土鱉蟲細粉各50 mg,置于試管中,分別加入1、2、4、6、8 mol/L 的鹽酸溶液20 mL,恒溫100 ℃水解22 h,按2.1項下方法處理。稀釋至50 mL后用氨基酸自動分析儀檢測,結(jié)果見圖1,橫坐標為鹽酸濃度cHCl,縱坐標為谷氨酸提取量m。由圖1可知,當鹽酸濃度為6 mol/L時提取率達到最高。

    圖1 鹽酸濃度對谷氨酸提取量的影響Fig.1 Effect of HCl concentration on glutamic acid extraction

    2.5 料液比對土鱉蟲氨基酸提取的影響

    2.6 提取時間對土鱉蟲氨基酸提取的影響

    精密稱取4份過40目篩的土鱉蟲細粉各50 mg,置于試管中,分別加入6 mol/L的鹽酸溶液20 mL,密封,在100 ℃恒溫條件下,分別提取14、18、22、26 h,然后按2.1項下方法處理。稀釋至50 mL后用氨基酸自動分析儀定量分析,結(jié)果見圖3,橫坐標為提取時間,縱坐標為谷氨酸提取量m。由圖3可知,土鱉蟲中谷氨酸的提取時間22 h為宜。

    圖3 提取時間對谷氨酸提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on glutamic acid extraction

    2.7 精密度試驗

    取2.2中濃度為0.1 μmol/mL的谷氨酸標樣對照液重復進樣6次,每次20 μL,分析精密度試驗結(jié)果,見表2,得到相對標準偏差(RSD)為0.24%(n=6),說明該儀器的性能良好,誤差較小,適用于快速分析。

    表2 精密度試驗

    2.8 重復性試驗

    精密稱取同一批次的土鱉蟲粉末樣品6份,按照2.1項下的方法配置溶液并進行含量測定,結(jié)果見表3,計算RSD為3.18%,表明本法重復性較好。

    表3 重復性試驗

    2.9 加樣回收率試驗

    表4 回收率試驗

    2.10 穩(wěn)定性試驗

    取樣品按2.1制備供試品溶液,按2.8條件在0、2、4、6、8 h后進行測定,分析結(jié)果見表5,由數(shù)據(jù)可知此方法穩(wěn)定性良好。

    表5 穩(wěn)定性試驗

    2.11 谷氨酸質(zhì)量分數(shù)測定

    采用建立的方法對不同產(chǎn)地和批次的土鱉蟲樣品進行分析,測定谷氨酸含量,結(jié)果見表6。不同地區(qū)土鱉蟲中谷氨酸含量存在較明顯差異,含量范圍為72.61~78.12 μmol/g,換算為質(zhì)量分數(shù)(w)即1.068%~1.149% ,其中浙江、山東樣品谷氨酸含量較高,云南、廣西樣品含量較低。

    表6 10批次土鱉蟲氨基酸含量的測定結(jié)果

    3 討論

    3.1 鹽酸濃度對氨基酸提取量的影響

    由圖1可知,谷氨酸提取量隨鹽酸濃度的增加呈先上升后下降的趨勢,變化幅度較大,當鹽酸濃度為6 mol/L時提取率達到最高。隨著鹽酸濃度增加,蛋白質(zhì)的水解程度增加,氨基酸的提取率增加,而鹽酸濃度過高時,過量的鹽酸可破壞氨基酸的結(jié)構(gòu),從而導致氨基酸的提取率下降。結(jié)果表明,6 mol/L的鹽酸濃度有利于土鱉蟲中谷氨酸的提取,同時又可節(jié)省溶劑用量和生產(chǎn)成本。

    3.2 料液比對土鱉蟲氨基酸提取的影響

    3.3 提取時間對土鱉蟲氨基酸提取的影響

    由圖3可知,隨著提取時間的增加,土鱉蟲中谷氨酸的提取量逐漸增大,當時間為22 h時提取量最大,之后提取量有所降低,推測可能是由于經(jīng)過一定時間的提取,蛋白質(zhì)已充分消解,繼續(xù)延長提取時間會破壞氨基酸的結(jié)構(gòu),提取量無法增加反而因長時間的作用而逐漸降低,故選時間22 h為宜。

    4 結(jié)論

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