美洲大蠊的生藥學(xué)及分子生藥學(xué)鑒定

蘇陽，徐凌川

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲[1]，俗名“蟑螂”。始載于我國的第一部藥物學(xué)專著——《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列蟲獸部中品，始稱“蜚廉”[2]，李時(shí)珍《本草綱目》中亦錄有別名石姜、負(fù)盤、滑蟲、茶婆蟲、香娘子等。其味咸、寒、有毒，主治血瘀、癥堅(jiān)、寒熱、喉咽痹、內(nèi)寒無子，有下氣、利血脈、破積聚的功效[3-7]。美洲大蠊用藥歷史悠久，現(xiàn)已被云南、湖南等多省藥材標(biāo)準(zhǔn)單獨(dú)收錄[8-9]。近年來，美洲大蠊的研究熱點(diǎn)多側(cè)重于其化學(xué)成分和藥理作用，發(fā)現(xiàn)其主要成分為信息素、氨基酸和各種昆蟲神經(jīng)肽[10]，具有抗腫瘤、抗病毒、促進(jìn)組織復(fù)生、鎮(zhèn)痛、抗炎以及保護(hù)心血管方面的作用[11-15]，以美洲大蠊為原藥的康復(fù)新液、心脈隆注射液、肝龍膠囊等中藥制劑現(xiàn)已在臨床應(yīng)用[16]。

中國已知蜚蠊種類近300種[17]，美洲大蠊常以干燥蟲體為中藥原料，隨著其臨床應(yīng)用日益廣泛，市場上出現(xiàn)了不少與美洲大蠊形態(tài)相似的品種，如德國小蠊Blattellagermanica和雄土鱉EupolyphagasinensisW.，存在摻假銷售現(xiàn)象。鑒于此，本文對美洲大蠊的外觀形狀特征進(jìn)行了詳細(xì)描述。又因美洲大蠊常以粉末形式在網(wǎng)上銷售，本文將對其粉末進(jìn)行生藥學(xué)和分子生藥學(xué)鑒定，為該藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Stemi 305高效體視顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司)；PH100-DB500U-IPL生物數(shù)碼顯微鏡，鳳凰PHMIAS2008圖像處理軟件(江西鳳凰光學(xué)股份有限公司)；5424R臺(tái)式離心機(jī) (德國 Eppendorf)；ABI 3730xl DNA 測序儀(美國 ABI 公司)；Bio-Rad 伯樂ChemicDocTM XRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)；B960 PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

美洲大蠊干燥蟲體，采購于濟(jì)南市長清區(qū)魯明生態(tài)養(yǎng)殖園，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室徐凌川教授鑒定為蜚蠊科大蠊屬昆蟲美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.的干燥蟲體。德國小蠊B.germanica和雄土鱉E.sinensis誘捕于山東中醫(yī)藥大學(xué)長清校區(qū)，經(jīng)烘干法得干燥蟲體。石油醚、水合氯醛、丙三醇均為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，蒸餾水(山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)。OMEGA動(dòng)物組織提取試劑盒(批號(hào)D5625-01) ，EasyTaq Buffer(批號(hào)M20833) EasyTaq聚合酶(批號(hào) M20823)，dNTP Mixture (批號(hào)M20805) 和DNA Marker(BM2000+1.5k， 批號(hào)L61023)，CO1引物(批號(hào)180810B52、18081B53，均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，測序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心分子測序中心完成。

2 方法

依照《中國藥典》2015年版一部中藥材粉末鑒定方法[18]，將藥材樣品粉碎，再對藥材粗粉用石油醚脫脂處理，揮干醚液，過4號(hào)篩(65目篩)后，混合均勻[19]。取粉末少許至載玻片上，分別用水合氯醛溶液、稀甘油、蒸餾水裝片后置于生物顯微鏡下觀察粉末顯微特征，并用顯微鏡配備的鳳凰PHMIAS2008圖像處理軟件對粉末特征進(jìn)行圖像采集以及測量分析[20]。

DNA提取及序列擴(kuò)增采用OMEGA動(dòng)物組織提取試劑盒(以下簡稱試劑盒)，具體實(shí)驗(yàn)操作參考使用說明書。昆蟲種屬鑒定是基于線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基1 (CO1)的DNA 條形碼[21]。

PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中EasyTaq聚合酶0.25 μL， 10×EasyTaq Buffer 2.5 μL， dNTPs(2.5 μmol·L)2.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL(10 μmol/L)，DNA 模板2.0 μL(20～50 ng/L)，無菌超純水補(bǔ)足至 25 μL。PCR擴(kuò)增上游引物L(fēng)CO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAA AAATCA-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增[22-24]。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 1 min、94 ℃ 1 min、45 ℃ 1.5 min、72 ℃ 1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。測序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心測序中心完成。數(shù)據(jù)處理：測序峰圖利用Seq Man、CodonCode Aligner V等軟件進(jìn)行基因序列拼接整理，獲得CO1序列。并與GenBank收錄的美洲大蠊的CO1基因序列進(jìn)行相似性對比。通過DNA條形碼檢測傳統(tǒng)鑒定學(xué)的準(zhǔn)確性。

3 鑒別

3.1 性狀鑒別

美洲大蠊干燥蟲體呈類卵圓形，赤褐色，頭部略平窄尾部寬。整體長27～32 mm，寬9～27 mm，厚度6～10 mm，雌體比雄體微大[25]。前胸背板略作梯形，中部有一赤褐以至黑褐蝶形斑，中線前緣有黃色“T”形小斑，后緣緩弧形。雄體腹部各節(jié)背板后側(cè)角為直角，鈍圓，雌體后端數(shù)節(jié)向后略突出。翅發(fā)達(dá)，雄體翅超出腹端，雌體翅伸至腹端。雄體肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角缺口，腹部第一背板無毛茸；雌體肛上板略呈長三角形，不透明，后緣呈三角形切口。足三對，下足露于蟲體外。體較輕，質(zhì)脆易折斷，氣腥，味微咸。

蜚蠊形態(tài)大小有差異，歷代本草中均有記載，基本可從其大小、形狀和顏色等方面與正品進(jìn)行區(qū)分。市場上常見美洲大蠊混淆品主要是德國小蠊和雄土鱉。現(xiàn)代性狀鑒別多結(jié)合其前胸背板形狀、翅膀形狀及其氣味等特點(diǎn)進(jìn)行鑒別。鑒別要點(diǎn)見表1。

表1 美洲大蠊及市面上常見偽品的性狀鑒別要點(diǎn)

3.2 顯微鑒別

美洲大蠊粉末顯微實(shí)物圖見圖1。

注：A—體壁碎片；B—橫紋肌碎片；C—粗剛毛；D—細(xì)剛毛；E—復(fù)眼碎片；F—翅膀碎片。圖1 美洲大蠊粉末顯微實(shí)物圖Fig.1 Micrograph of P. americana powder

3.2.1 體壁碎片

黃色或黃棕色[26]體壁碎片，具網(wǎng)狀紋理，有時(shí)可見類圓形壁孔，壁孔邊緣顏色變深；黃棕色或淡黃色體壁碎片，具類六邊形或魚鱗狀紋理；黃棕色體壁碎片，表面平滑而附有虛線白點(diǎn)狀紋理，偶見透明類圓狀毛窩；黃棕色或黃褐色體壁碎片，表面常見圓點(diǎn)狀毛窩；淺黃色或無色具魚鱗狀突起的體壁碎片；淺黃色或無色體壁碎片，表面圓凸，密布細(xì)短的剛毛；部分體壁碎片有明顯的內(nèi)外壁分層，外壁折斷后突顯出色淡或無色的內(nèi)壁。

3.2.2 橫紋肌

橫紋肌纖維常見[27]，棕黃色或無色透明，橫紋排列細(xì)密，有時(shí)或交叉、或垂直、或螺旋狀散在。

3.2.3 剛毛

剛毛有粗細(xì)兩種[28]。粗剛毛：常見，長圓錐形，平直或略彎曲，深棕色或棕褐色，長96～217 μm，中段直徑14～31 μm，多斷裂；基部呈類圓形，略膨大，后向上略有凹陷；中段顏色加深；頂端鈍圓，顏色與基部顏色大體一致；于高倍鏡下觀察，剛毛全體自基部凹陷處以上開始，附著有緊貼表面且尖部朝上的寬扁形毛刺，延伸至剛毛頂端時(shí)，毛刺逐漸變圓，呈膨弧狀，有時(shí)可見毛刺間的溝壑；髓腔發(fā)達(dá)，基本貫通剛毛全體，基部腔體直徑可達(dá)總直徑的一半，腔內(nèi)中空或殘留黑色毛髓。細(xì)剛毛：常見，披針形或針形，平直或稍彎曲，黃色或黃棕色，長80～317 μm，中段直徑4～12 μm，多自基部斷裂；完整者可見基部略膨大形似鉚釘；頂端尖銳；表面平滑，無紋理；髓腔細(xì)長通透，無髓質(zhì)。

3.2.4 復(fù)眼碎片

復(fù)眼碎片少見，單眼[29]呈正六邊形或類圓形，中央白凈，各單眼相交邊緣呈磨砂粒感的暗灰色。

3.2.5 翅膀碎片

翅膀碎片偶見，黃綠色或淺黃色，表面有鱗狀或波紋狀的紋理密布。

3.2.6 脂肪油滴

脂肪油滴[30]常見，黃色或淺黃色，略顯透亮，類圓形或類橢圓形，單個(gè)或聚集成團(tuán)狀散在。

3.2.7 常見偽品顯微特征

德國小蠊與美洲大蠊的體壁碎片及其他碎片顯微觀察未見明顯差異，兩者主要差異在于剛毛的疏密程度。美洲大蠊剛毛多斷裂散在分布，位于體壁上的剛毛分布較密，而德國小蠊體壁剛毛分布稀疏。雄土鱉粉末呈深棕色至褐色，與前兩者顏色相比，視野下粉末顏色明顯加深，差異明顯，可作為顯微鑒定的區(qū)分項(xiàng)。另外，雄土鱉偶見表面具刺突的剛毛，是其特有剛毛類型。

3.3 PCR擴(kuò)增及序列分析

以提取的美洲大蠊待測樣本基因組DNA為模板，采用DNA條形碼中的動(dòng)物通用引物CO1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。用DNA Marker D(100～2000 bp)檢測擴(kuò)增片段DNA長度，以確保擴(kuò)增結(jié)果有效。在紫外光下觀察可擴(kuò)增出一條明顯的特異性條帶，與Marker區(qū)間對比，DNA長度為700 bp左右(圖2)，結(jié)果說明PCR擴(kuò)增結(jié)果可用。將測序所得序列進(jìn)行拼接及人工校對，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)。經(jīng)雙向測序、拼接，所得序列片段長度與PCR擴(kuò)增結(jié)果基本一致。用NCBI GenBank進(jìn)行在線BLAST比對，與P.americana的CO1序列匹配度都很高，同源性100%，表明擴(kuò)增和測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠，分子生藥學(xué)方法能夠準(zhǔn)確鑒別美洲大蠊正品。

注：1—空白；2～4—美洲大蠊樣品；M—DNA Marker。圖2 CO1基因片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of CO1 gene fragment

4 結(jié)論與討論

美洲大蠊蟲體卵圓形，前胸背板近梯形，前胸背板中部的蝶形斑，是其區(qū)別于偽品的顯著特征。雄性美洲大蠊翅膀較長超出腹端，雌性與腹端齊平。從顯微鑒別特征來看，美洲大蠊剛毛有粗細(xì)兩種，粗剛毛常見，長圓錐形，基部略膨大，向上逐漸凹陷，頂端鈍圓，髓腔發(fā)達(dá)貫穿全體，偶見黑色髓質(zhì)。不同部位蟲體碎片略有差別，多具網(wǎng)狀或鱗狀紋理。對不同批次的美洲大蠊顯微鑒別結(jié)果表明，美洲大蠊不同部位的顯微特征不同，相同顯微鑒別特征可能分布在不同部位，其碎片和剛毛可作為區(qū)分其他粉末的主要依據(jù)。結(jié)合分子鑒定，說明該生藥學(xué)鑒定方法可以準(zhǔn)確鑒定美洲大蠊?，F(xiàn)有的資料對美洲大蠊及其常見偽品的鑒別報(bào)道很少，本文首次將美洲大蠊與市面上常見偽品德國小蠊及雄土鱉進(jìn)行鑒別，所以鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性有力地保障了質(zhì)量控制方面的進(jìn)一步研究。

該實(shí)驗(yàn)對美洲大蠊中藥材粉末鑒定的前期處理做了優(yōu)化。在實(shí)驗(yàn)初期，未對美洲大蠊粉末進(jìn)行脫脂處理，發(fā)現(xiàn)顯微視野下粉末的脂肪油滴過多，對實(shí)驗(yàn)的正常觀察造成了不小影響。而脫脂后的美洲大蠊的粉末，在顯微鏡下特征明顯，顏色分明，使實(shí)驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期的效果。美洲大蠊粉末碎片種類較多，觀察起來較為繁瑣，針對于此種情況，實(shí)驗(yàn)中分別將美洲大蠊翅膀、腹部、頭部、胸部粉碎后各自觀察。在記錄特征之后，再對美洲大蠊全身的粉末進(jìn)行顯微鑒別。用此種方法可以較系統(tǒng)全面地識(shí)別美洲大蠊粉末的顯微特征，快速將其與其他粉末區(qū)別。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，對于經(jīng)水合氯醛透化制成的臨時(shí)裝片，實(shí)際的觀察效果不如水合氯醛、甘油或蒸餾水的冷裝片效果好。所以建議觀察美洲大蠊粉末前，先將粉末進(jìn)行脫脂處理，再冷裝片觀察。形態(tài)學(xué)鑒定在中藥鑒定學(xué)研究中仍普遍適用，且短期之內(nèi)其方法不會(huì)被取代。由于CO1基因片段保守性強(qiáng), 適于親緣關(guān)系較近的昆蟲分子系統(tǒng)研究，故本實(shí)驗(yàn)未對其全部種類進(jìn)行分子鑒定。本次實(shí)驗(yàn)，筆者總結(jié)了美洲大蠊的性狀及其粉末顯微特征和分子鑒定結(jié)果，希望可以為鑒別美洲大蠊提供參考資料。

美洲大蠊作為傳統(tǒng)藥用昆蟲，在抑菌和促進(jìn)傷口愈合方面效果顯著，對增強(qiáng)心臟功能、治療肝炎和肝纖維化也有作用。目前，云南、四川和山東等地人工養(yǎng)殖美洲大蠊初具規(guī)模，市面上開發(fā)出了以美洲大蠊為原料的復(fù)方制劑，以其為中心的產(chǎn)業(yè)鏈已具雛形。美洲大蠊中藥劑型的品質(zhì)和其粉末的質(zhì)量關(guān)系密切[31]，但就目前而言，基礎(chǔ)研究仍有不足，下一步應(yīng)該加強(qiáng)質(zhì)量控制方面的研究，將更多品質(zhì)更佳的美洲大蠊投入市場。