湖北地區(qū)茯苓飲片質(zhì)量標準研究

王運芳，秦 文，林華清，陳劍鋒，鄒 坤*

(1.天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，三峽大學生物與制藥學院，湖北 宜昌 443002；2.湖北恒安芙林藥業(yè)有限公司，湖北 宜昌 443103)

茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 為多孔菌科臥孔菌屬真菌茯苓的干燥菌核[1-2]，主要分布在我國云南、湖北、安徽、湖南等地[3]，是中國延用千年的傳統(tǒng)中藥，可與多種中藥相互配伍，且不分季節(jié)，不管寒、溫、風、濕等疾病，都能發(fā)揮其獨特功效，亦可食用[4].經(jīng)研究，茯苓化學成分有三萜類、多糖類、甾體、脂肪酸、蛋白質(zhì)、腺嘌呤、組氨酸、樹膠、膽堿、卵磷脂、氨基酸以及鈣、鎂、鐵、鉀等無機元素.其中主要成分為多糖和三萜類成分[5]，茯苓多糖屬于真菌多糖，主要由水溶性多糖和堿溶性多糖組成[6].在三萜類化合物中去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸等含量較高[7-11].研究表明其有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗炎等多方面藥理作用[12-13]，還有保肝、抗衰老、降血糖等作用[14-15].

主要受藥材的產(chǎn)地、采收時間、加工方法和貯存等因素的影響，茯苓飲片的質(zhì)量參差不齊.本課題參照國家藥監(jiān)局發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術要求》，在中醫(yī)藥理論的指導下對茯苓飲片進行了系統(tǒng)的研究，建立了茯苓中水溶性多糖的含量測定方法，HPLC法測定茯苓中茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸的含量，在《中國藥典》(2020年版)的基礎上豐富了茯苓飲片質(zhì)量標準的內(nèi)容.為提高茯苓藥材的利用率，促進中藥材的產(chǎn)地深加工和產(chǎn)業(yè)結構調(diào)整，并帶動中藥材種植業(yè)、中醫(yī)藥知識經(jīng)濟等相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了較為科學的依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀(戴安公司)；電子天平(上海民橋精密儀器有限公司)；SX-2.5-10型馬弗爐(上海洪紀儀器設備有限公司)；UV-3100Spectrophotometer(上海美譜達儀器有限公司)；BCD-228CH冰箱(河南新飛電器集團有限公司)；電子天平(上海民橋精密儀器有限公司)；78-1型磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(鄭州科豐儀器設備有限公司)；DLSB-5/-20℃ 低溫冷卻液循環(huán)泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；SB-2000 水浴鍋(上海愛朗儀器有限公司)；GZX-9240 MBE 數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；低溫離心機(德國 Eppendorf公司).

1.2 試劑

石油醚(60～90 ℃)(國藥集團化學試劑有限公司)；正丁醇(國藥集團化學試劑有限公司)；三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司)；乙酸乙酯(天津市富宇精細化工有限公司)；95%乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；濃硫酸(河南信陽化工廠)；重蒸苯酚(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；甲醇(TEDIA公司)；乙腈(TEDIA公司)；純凈水(華潤怡寶飲料(中國)有限公司).甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純.

1.3 藥材

茯苓飲片10個批次(批號161101～161110)的原料經(jīng)三峽大學醫(yī)學院曾建紅教授鑒定為多孔菌科臥孔菌屬真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf，植物標本現(xiàn)保存于天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室.飲片的樣品信息見表1.

表1 茯苓飲片的樣品來源信息Tab.1 Sources of processed slices of Poria cocos

2 方法與結果

2.1 形狀和顏色

茯苓飲片共10個批次，均為去皮后切制成的立方塊狀，可大小不一，顏色白色或淡棕色.

2.2 鑒別

主要參照《中國藥典》2020年版一部收載茯苓飲片項下的檢驗方法.由圖片可見菌絲無色或淡棕色，細長，稍彎曲，有分枝，直徑3～8 μm，少數(shù)至16 μm.見圖1(放大200倍).

圖1 茯苓飲片的顯微鑒定圖Fig.1 Microscopic identification of decoction piece of Poria cocos

2.3 水分的測定

精密稱取茯苓飲片粉末(過 100目篩)各5 g，按《中國藥典》2020年版通則0832第二法(烘干法)，分別測定10批次茯苓飲片的含水量，結果見表2.依據(jù)《中國藥典》2020年版，水分不得超過18.0%，故10批次樣品中有6批次不合格.

表2 茯苓飲片水分含量測定結果(n=3)Tab.2 Determination results of water content in decoction slices of Poria cocos (n=3)

2.4 總灰分的測定

精密稱取茯苓飲片粉末(過 100目篩)各5 g，按《中國藥典》2020年版通則2302，分別測定10批次茯苓飲片的總灰分，結果見表3.僅有一批次樣品總灰分超過2.0%為不合格.

表3 茯苓飲片總灰分含量測定結果(n=3)Tab.3 Determination results of total ash content in decoction slices of Poria cocos (n=3)

2.5 浸出物的測定

精密稱取茯苓飲片粉末(過100目篩)各5 g，按照《中國藥典》2020年版通則2201醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定，結果見表4.按照2020版標準，醇溶性浸出物不得少于2.5%，則10批樣品均合格.

表4 茯苓飲片浸出物的測定結果(n=3)Tab.4 Determination results of extract from decoction slice of Poria cocos (n=3)

2.6 茯苓飲片二氧化硫殘留量

精密稱取茯苓飲片粉末(過 100目篩)各10 g，按照《中國藥典》2020年版通則2331二氧化硫殘留量測定法項下的第一法(酸堿滴定法)，結果見表5.

表5 茯苓飲片二氧化硫殘留量的測定結果(n=3)Tab.5 Determination results of sulfur dioxide residue in decoction slices of Poria cocos (n=3)

由表5可知，10批次茯苓飲片的二氧化硫殘留量在7～11 mg·kg-1范圍內(nèi)，為茯苓飲片質(zhì)量標準制定提供參考依據(jù).

2.7 茯苓飲片中水溶性多糖的含量測定

茯苓粗多糖和精制多糖的制備[16]：稱取茯苓粉末10 g(過60目篩，50 ℃烘干24 h)，置索氏提取器中，加入石油醚100 mL，90℃回流提取2 h，抽濾.藥渣揮盡有機溶劑后，置于圓底燒瓶中，加蒸餾水100 mL，稱總重量，水浴回流2 h后擦干燒瓶外表面，稱重后加蒸餾水補足減失重量，搖勻，抽濾.精密量取續(xù)濾液50 mL，濃縮至5 mL.加入95%乙醇25 mL，于4℃冰箱中放置過夜，離心(3 500 r·min-1，15 min).棄去上清液，將沉淀干燥至恒重，即得到茯苓粗多糖.

將茯苓粗多糖用5 mL蒸餾水復溶，加5 mL Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，混勻后反復振搖、離心(2 000 r·min-1，10 min)，留下水層，重復多次去除蛋白.將水層先在200 ～ 400 nm紫外光譜段進行掃描，260 ～ 280 nm范圍內(nèi)無吸收峰，再用考馬斯亮藍法測蛋白含量.向濃縮液中加入適量30% H2O2原液(體積比)，用0.5 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至8，45 ℃水浴4 h，將多糖脫色液置于透析袋中，透析袋中無氣泡，兩端需夾緊.先用自來水流動透析1 d，再用蒸餾水透析3 d，每12 h更換一次蒸餾水.透析后過濾，濃縮至5 mL.加入95%乙醇25 mL，于4 ℃冰箱中放置過夜，離心(3 500 r·min-1，15 min)，棄去上清液，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，50 ℃真空干燥，即得茯苓精制多糖.

2.8 PMP衍生化法測定粗多糖和精制多糖的單糖組成

衍生化供試品的制備：精密稱取茯苓粗多糖10 mg和茯苓精制多糖5 mg，吹氮氣，各加入2 mol·L-1三氟乙酸1 mL(通風處取用)，搖勻，立即封管，水浴6 h.從中各取出400 μL水解液置具塞試管中，加甲醇適量，氮氣吹干，重復操作直到完全清除三氟乙酸.在水解供試品中加0.3 mol·L-1NaOH溶液和0.3 mol·L-1的PMP溶液各100 μL，混合均勻，于70 ℃水浴100 min，冷卻至室溫后加0.3 mol·L-1HCl溶液100 μL中和，加蒸餾水至1 mL，最后各加入1 mL三氯甲烷除去未反應的PMP，棄去油相，重復3次.將茯苓粗多糖和茯苓精制多糖水相分別以0.45 μm濾膜過濾后，取續(xù)濾液備用.

HPLC條件：色譜柱型號為依利特C18柱，250 mm × 4.6 mm，5 μm；流動相為乙腈(A)-0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH6.7)(B)，等梯度洗脫，有機相和水相比例為18(A):82(B)；二極管陣列UV-VIS檢測器；檢測波長為250 nm；柱溫為25 ℃，流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL.多糖標準品、茯苓粗多糖、茯苓精制多糖的PMP衍生物HPLC圖分別見圖2(a)、2(b)和2(c).

1.甘露糖mannitose;2.鼠李糖rhamnose;3.葡萄糖glucose;4.半乳糖galactose;5.木糖xylose圖2 多糖標準品、茯苓粗多糖和精多糖的PMP衍生物HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of PMP derivatives of standard polysaccharides，crude polysaccharides of Poria cocos and refined polysaccharides

由圖2可知，茯苓多糖精制前后多糖中甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的組成沒有發(fā)生明顯變化.

供試品溶液的制備.稱取茯苓粉末10 g(過60目篩，50 ℃烘干24 h)，置索氏提取器中，加入石油醚100 mL，90 ℃回流提取2 h，抽濾.藥渣揮盡有機溶劑后，置于圓底燒瓶中，加蒸餾水100 mL，稱總重量，水浴回流2 h后擦干燒瓶外表面，稱重后加蒸餾水補足減失重量，搖勻，抽濾.精密量取續(xù)濾液50 mL，濃縮至5 mL.加入95%乙醇25 mL，于4 ℃冰箱中放置過夜，離心(3 500 r·min-1，15 min).分離上清液，備用.將沉淀用蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，精密移取2.0 mL至10.0 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得水溶性多糖供試品溶液.

對照品溶液的制備.精密稱量干燥至恒重的葡萄糖對照品0.100 4 g，加蒸餾水定容至100 mL，搖勻，制成濃度為1.004 mg·mL-1的儲備液.精密移取此溶液10 mL于50 mL棕色容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得.

最大吸收波長的選擇.精密吸取葡萄糖對照品溶液和供試品溶液各1 mL，分別置20 mL 試管中，分別精密加入現(xiàn)配的5%重蒸苯酚溶液1 mL，振搖均勻后，立即精密移取濃硫酸6 mL，貼壁緩慢加入，邊加邊振搖均勻，避光靜置40 min后搖勻.在紫外可見分光光度儀上，于200 ～ 700 nm進行光譜掃描，選吸收值最大的波長.對照品溶液和供試品溶液最大吸收波長都在489 nm.

標準曲線的繪制.分別精密吸取對照品溶液適量，配制成10.040 μg·mL-1、20.080 μg·mL-1、40.120 μg·mL-1、60.240 μg·mL-1、80.320 μg·mL-1、120.480 μg·mL-1的系列溶液.精密移取以上葡萄糖對照品溶液各1.0 mL，于20 mL試管中，按照“2.12”項下顯色方法顯色并測定吸光度.經(jīng)計算得回歸方程：y=0.0076x+0.0864(r=0.9995，n=5)，葡萄糖在10.040 ～ 120.480 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好.

轉(zhuǎn)換因子的測定精密稱取2.5 mg茯苓精制多糖于EP管中，加蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移到50 mL棕色容量瓶，并將EP管洗滌3次，洗滌液全部轉(zhuǎn)移到到容量瓶，加蒸餾水至刻度線定容，搖勻.精密移取1 mL茯苓精制多糖溶液于具塞試管中，按照“2.12”項下顯色方法顯色并測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算多糖溶液中葡萄糖的濃度，根據(jù)公式

F=m/c×D，

其中，m為多糖質(zhì)量(mg)，c為多糖中葡萄糖濃度(mg·mL-1)，D為稀釋倍數(shù),測得換算因子F=2.10 (n=5).

2.9 精密度試驗

精密量取1 mL葡萄糖對照品溶液，按“2.12”項下方法顯色并測定其吸光度，平行測定6次，記錄吸光度值，根據(jù)回歸方程計算對照品溶液的葡萄糖含量.計算結果RSD=0.46%，表明此臺紫外可見分光光度計的精密度良好.

2.10 穩(wěn)定性試驗

按照“2.7”項下提取方法制備1份茯苓供試品溶液(批號161101).精密量取供試品溶液1 mL于具塞試管中，按照“2.12”項下方法顯色并測定吸光度值1，靜置1 h后搖勻，測定并記錄吸光度值2；靜置2 h后搖勻，測定并記錄吸光度值3；靜置2 h后搖勻，測定并記錄吸光度值4.根據(jù)回歸方程計算0～3 h內(nèi)4個時間點的供試品溶液的濃度，并計算結果的RSD=0.59%，表明供試品溶液在3 h內(nèi)顯色穩(wěn)定.

2.11 重復性試驗

按照“2.7”項下提取方法平行制備6份茯苓供試品溶液(批號161101).精密量取各供試品溶液1 mL，分別置于具塞試管中，按照“2.12”項下方法顯色并測定吸光度，結果RSD=3.01%表明該方法重復性良好.

2.12 樣品含量測定

精密量取各批次茯苓水溶性多糖供試品溶液各1.0 mL，精密加入1.0 mL現(xiàn)配的5%重蒸苯酚溶液，充分混合后，緩慢精密加入6.0 mL濃硫酸，振搖均勻后，立即精密移取濃硫酸6.0 mL，貼壁緩慢加入，邊加邊振搖均勻，避光靜置40 min后搖勻.于紫外可見分光光度儀上，以吸收波長489 nm測定樣品溶液的吸光度值，并根據(jù)回歸方程計算供試品中水溶性多糖的含量.結果見表6.

表6 茯苓供試品中水溶性多糖的含量測定結果(n=3)Tab.6 content determination results of water-soluble polysaccharide in Poria Cocos samples(n=3)

2.13 加樣回收率試驗

稱取已知含量的同一批茯苓樣品粉末(批號161110) 6 份，每份約0.2 g，分別加入精制多糖約22 mg，按照“2.7”項下制備供試品溶液和“2.12”項下方法顯色并測定吸光度，計算回收率，結果平均回收率為99.14%，RSD=1.01%，表明方法準確度良好，結果見表7.

表7 茯苓多糖加樣回收率實驗(n=6)Tab.7 Recovery of Poria Cocos Polysaccharide (n=6)

3 茯苓飲片中茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸的含量測定

3.1 供試品及對照品溶液的配制

茯苓酸對照品溶液：精密稱取4.583 mg茯苓酸對照品于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，并定容，搖勻.即得濃度為458.3 μg·mL-1的對照品溶液，備用.

去氫茯苓酸對照品溶液：精密稱取1.001 mg去氫茯苓酸對照品于5 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，并定容，搖勻.即得濃度為200.2 μg·mL-1的儲備液，備用.

松苓新酸對照品溶液：精密稱取1.834 mg松苓新酸對照品于5 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，并定容，搖勻.即得濃度為366.7 μg·mL-1的儲備液，備用.

供試品溶液的配制：取“2.7”項下分離的上清液，50 ℃減壓濃縮后冷凍干燥至恒重.精密稱量樣品各0.1 g，用甲醇定容至5.0 mL容量瓶，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，備用.

HPLC條件色譜柱：依利特C18( 250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：去氫茯苓酸和松苓新酸為254 nm，茯苓酸為210 nm；流速：1 mL·min-1；進樣量：50 μL；溫度：25 ℃.流動相條件，液相條件為：0～30 min為甲醇：0.25%磷酸水溶液=10:90～65:35；30～90min為甲醇∶0.25%磷酸水溶液=65∶35～90∶10；90～95 min為甲醇∶0.25%磷酸水溶液=90∶10.

3.2 專屬性試驗

在選定的條件下，茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸對照品與樣品中其它組分色譜峰可基線分離，無干擾.按茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸峰計算，理論塔板數(shù)為4 000以上.茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸對照品、供試品的高效液相色譜圖見圖3.

(a)茯苓酸(210 nm)；(b)去氫茯苓酸(254 nm)；(c)松苓新酸(254 nm)；(d)茯苓樣品(210 nm)；(e)茯苓樣品(254 nm)(a)Pachymicacid (210 nm);(b)Dehydropachymic acid (254 nm);(c)Poricoic acid (254nm);(d)Poria cocos sample (210 nm);(e) Poria cocos sample (254 nm)圖3 對照品和樣品HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of reference substance and sample

3.3 線性關系的考察

分別精密吸取系列梯度濃度的茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸對照品溶液10 μL不同濃度注入液相色譜儀中，按“3.1”項下HPLC條件測定其峰面積.茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸的線性范圍如表8所示.

表8 茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸的線性范圍Tab.8 Linear ranges of porylic acid，dehydrogenated porylic acid and pinoleic acid

結果表明茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸分別在在1.4～458.3 μg·mL-1、4.2～250.0 μg·mL-1及0.6～91.7 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關系.

3.4 精密度試驗

分別精密吸取對茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸對照品溶液10 μL，重復進樣3次，計算得出茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸的RSD分別為0.61%、1.56%和1.69%(n=3)，結果表明儀器精密度好.

3.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、24 h各進樣10 μL，以茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸峰面積計算，RSD分別為l.l4%、1.68%和1.95%(n=3)，結果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

3.6 重復性試驗

精密稱定同一批次茯苓飲片10 g，共3份，按上述方法制備供試液，進樣測定，計算得茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸的RSD分別為1.90%、1.37%和1.12%(n=3)，結果表明該法重復性好.

3.7 樣品含量測定

取“3.1”項下供試品溶液，按“3.1”項下HPLC條件測定其峰面積.計算得樣品中茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸的平均百分含量分別為0.269%、0.593%和0.379%.詳細百分含量結果見表9.

表9 茯苓飲片中茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸的含量測定(n=3)Tab.9 Determination of content of poria acid， dehydrogenated poria acid and pinoleic acid in prepared slices of poria cocos(n=3) /%

3.8 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批次茯苓樣品粉末(161110)約0.05 g，于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，平行3份.另取茯苓酸對照品、去氫茯苓酸對照品及茯苓新酸對照品，將3種對照品分別用甲醇制成每1 mL 含0.150 2 mg、0.150 1 mg及0.150 3 mg的混合對照品溶液.精密加入上述混合對照品溶液1 mL ，并用甲醇定容，按供試品溶液制備方法操作.按“3.1”項下方法HPLC條件進行測試，計算回收率，茯苓酸的平均回收率為100.3%(RSD=1.70%)，去氫茯苓酸平均回收率為101.3%(RSD=1.94%)，松苓新酸平均回收率為100.9%(RSD=1.45%)表明方法準確度良好.

表10 茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸加樣回收率實驗(n=3)Tab.10 The recovery rateswith pachylic acid，dehydropachylic acid and pachylic neoacid were added (n=3)

4 討論

《中國藥典》2020年版茯苓飲片質(zhì)量標準中規(guī)定了性狀、鑒別、檢查、浸出物等項的檢驗，但這些指標不能全面、系統(tǒng)的控制飲片的質(zhì)量.因茯苓在加工、貯藏等環(huán)節(jié)仍可能存在隨意使用硫磺熏蒸的情況，故在本文中增加了二氧化硫殘留量的研究；且藥材質(zhì)量的優(yōu)劣在一定程度上可以通過有效成分含量的高低來反映，因此對茯苓中的多糖及三種三萜類化合物即茯苓酸、去氫茯苓酸和松苓新酸進行了進一步研究.

經(jīng)測定10批次茯苓飲片含水量為15.6%～30.5%；總灰分為0.2%～2.8%;醇溶性浸出物為2.9%～7.0%；10批次茯苓飲片中均能不同程度地檢出二氧化硫，范圍為6～11 mg·kg-1；水溶性多糖的平均百分含量為0.251 6%.茯苓飲片中茯苓酸、去氫茯苓酸、松苓新酸的平均百分含量分別為0.259 2%、0.557 9%、0.353 8%，且別在1.4～458.3 μg·mL-1、4.2～250.0 μg·mL-1和0.6～91.7 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關系.按照《中國藥典》2020年版規(guī)定分析出10批次藥品中水分檢測項中不合格的有6批，總灰分檢測項中不合格的有1批；溶性浸出物檢測中均合格；10批次樣品中均能檢測出二氧化硫.綜上所述，本文對茯苓飲片質(zhì)量標準進行了較為系統(tǒng)的研究，該方法簡便、穩(wěn)定、專屬性強、重復性好，且本課題可提高茯苓藥材的利用率，促進中藥材的產(chǎn)地深加工和產(chǎn)業(yè)結構調(diào)整，并帶動中藥材種植業(yè)、中醫(yī)藥知識經(jīng)濟等相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.