鹽酸奧普力農(nóng)注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

焉媛媛 趙志龍 林 鵬 王秀英

遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧沈陽(yáng) 110036

急性心力衰竭又稱急性心功能不全，是由于心排血量短期內(nèi)急劇下降所導(dǎo)致的疾病。多見于血壓突然升高時(shí)、急性心肌炎、急性心肌梗死等急性心肌彌漫性損害時(shí)；瓣膜嚴(yán)重狹窄、心室流出道梗阻導(dǎo)致急性機(jī)械性阻塞心臟排血受阻時(shí)；心室顫動(dòng)、顯著心動(dòng)過(guò)速等導(dǎo)致致命性心律失常時(shí)；由于上述原因引起急性心力衰竭的發(fā)生。鹽酸奧普力農(nóng)是日本株式會(huì)社開發(fā)研制的用于治療急性心力衰竭的藥物，化學(xué)名為1，2-二氫-5-咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基-6-甲基-2-氧代-3-吡啶碳氰鹽酸鹽一水合物，分子式C14H10N40·HCl·H20，鹽酸奧普力農(nóng)選擇性地阻礙環(huán)磷腺苷的特異的磷酸二酯酶（PDE），具有增強(qiáng)心收縮力和擴(kuò)張血管的作用。鹽酸奧普力農(nóng)于1982年開始研究，1986年開始臨床，1996年在日本正式上市，證明對(duì)急性心力衰竭有明顯治療效果。鹽酸奧普力農(nóng)不僅可以增加心肌的耗氧量，還增加心肌輸出量，比兒茶酚胺改善心肌能量有效率高，主要應(yīng)用于其他藥物療效不佳的急性心力衰竭的短期靜脈治療，臨床上廣泛應(yīng)用。鑒于鹽酸奧普力農(nóng)注射液的這些優(yōu)勢(shì)，本文對(duì)此進(jìn)行研究，以控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料

1.1 受試物

鹽酸奧普力農(nóng)注射液（沈陽(yáng)雙鼎制藥有限公司，批號(hào) S181101，規(guī)格：5 ml∶ 5 mg）。

1.2 鱟試劑

湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)1801082，規(guī)格：0.1 ml/支，靈敏度0.125 EU/ml；湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)1809032，規(guī)格：0.1 ml/支，靈敏度0.125 EU/ml。

1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號(hào)18016003，規(guī)格：5 ml/支。

1.4 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品

批號(hào)150601-201885，效價(jià)80 EU/支，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.5 儀器設(shè)備

電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號(hào)XSE204，設(shè)備編號(hào)B64940782；內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司，型號(hào)ET-96，出廠編號(hào) 05-23-17。

1.6 實(shí)驗(yàn)條件

保溫溫度（37±1） ℃。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）復(fù)核

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行檢查。在規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即鱟試劑的標(biāo)示靈敏度。當(dāng)新購(gòu)的鱟試劑使用新批號(hào)時(shí)或條件發(fā)生變化而影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，都應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核[3-4，6，9-10]，以確保產(chǎn)品質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。具體操作先將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至2λ、λ、0.5λ、0.25λ4個(gè)濃度，每個(gè)濃度做4管，加樣后用封口膜封好，輕輕混勻，（37±1）℃保溫1 h。結(jié)果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度標(biāo)定結(jié)果

結(jié)果表明，最大濃度2λ各管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ各管均為陰性，陰性對(duì)照是陰性，本次實(shí)驗(yàn)成立。所選用兩個(gè)廠家的鱟試劑標(biāo)示靈敏度均在0.5λ～2λ之間，表明鱟試劑靈敏度符合規(guī)定，可以用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)本品的臨床用法用量，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部[2]通則9301“注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定，并求得最大無(wú)干擾濃度。

限值計(jì)算公式[7-8，11]為：L=K/M，M為人用每千克體重每小時(shí)最大劑量，本品臨床用量為：0.01 mg/kg+0.0004 mg/（kg·h）×55=0.032 mg/（kg·h）。K 為人用每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5EU/（kg·h）。計(jì)算本品限值為：L=K/M=5 EU/（kg·h）/0.032 mg/（kg·h）=156 EU/mg。

經(jīng)計(jì)算本品理論限值為156 EU/mg，本品擬定申報(bào)限值為50 EU/mg，約為計(jì)算限值的1/3，限值設(shè)置合理。擬定本品內(nèi)毒素限值為每1 mg鹽酸奧普力農(nóng)中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于50 EU。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

本次進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的是，找出供試品溶液中未檢出內(nèi)毒素并且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)的溶液，以確定本次供試品溶液的濃度。本次選擇供試品溶液為0.0025～0.0800 mg/ml 6個(gè)系列濃度，陰性對(duì)照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，陽(yáng)性對(duì)照為2λ內(nèi)毒素溶液，供試品陽(yáng)性對(duì)照為供試品溶液稀釋的2λ內(nèi)毒素溶液，加完樣品后操作同鱟試劑靈敏度復(fù)核。見表2。結(jié)果表明，鹽酸奧普力農(nóng)注射液0.04 mg/ml濃度以下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查符合規(guī)定，0.04 mg/ml濃度以下對(duì)樣品無(wú)干擾。

2.4 正式干擾實(shí)驗(yàn)

根據(jù)干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定使用供試品溶液的最終濃度為0.04 mg/ml。所用的鱟試劑同鱟試劑靈敏度復(fù)核，靈敏度均為0.125 EU/ml。本實(shí)驗(yàn)分為兩組：一是檢查用水組將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至2λ、λ、0.5λ、0.25λ4個(gè)濃度，二是供試品組用鹽酸奧普力農(nóng)注射液0.04 mg/ml濃度的溶液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品也稀釋至相同的4個(gè)濃度，加完樣品后操作同鱟試劑靈敏度復(fù)核。見表3。

表2 鹽酸奧普力農(nóng)注射液干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 鹽酸奧普力農(nóng)注射液干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，用兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，鹽酸奧普力農(nóng)注射液0.04 mg/ml濃度以下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)干擾。

2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)[1，15]

根據(jù)擬定限值計(jì)算：C=λ/L=0.125 EU/ml/50 EU/mg=0.0025 mg/ml

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部[1]通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行。所用的鱟試劑同鱟試劑靈敏度復(fù)核，供試品濃度為0.0025 mg/ml溶液，陰性對(duì)照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，陽(yáng)性對(duì)照為2λ內(nèi)毒素溶液，供試品陽(yáng)性對(duì)照為供試液溶液稀釋的2λ內(nèi)毒素溶液。見表4。結(jié)果表明，按照擬定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，對(duì)1批鹽酸奧普力農(nóng)注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果符合規(guī)定。

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)室條件下，鹽酸奧普力農(nóng)注射液0.04 mg/ml濃度以下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)干擾，并對(duì)1批樣品按擬定的細(xì)菌內(nèi)毒素限值進(jìn)行檢查，結(jié)果符合規(guī)定。

4 討論

4.1 鹽酸奧普力農(nóng)注射液結(jié)果確定

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，鹽酸奧普力農(nóng)注射液對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素之間的反應(yīng)無(wú)干擾作用，限值設(shè)置合理，其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可行，可以控制產(chǎn)品質(zhì)量，以確保臨床用藥安全。

4.2 兩種實(shí)驗(yàn)方法的比較

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和傳統(tǒng)熱原檢查法的比較[5，12，16-17]，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是用鱟試劑做實(shí)驗(yàn)，其靈敏度高，準(zhǔn)確性強(qiáng)，操作方便，受客觀影響因素較少；熱原檢查法，需要用家兔做實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物成本高，誤差大，受客觀影響因素較多。現(xiàn)在已經(jīng)有越來(lái)越多的藥品施行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

4.3 鹽酸奧普力農(nóng)注射液藥理作用及臨床禁忌證

鹽酸奧普力農(nóng)注射液藥理和毒理作用[13-14]是：鹽酸奧普力農(nóng)是一種PDE的Ⅲ抑制劑，具有正性肌力作用和血管擴(kuò)張作用，主要通過(guò)抑制PDE，使心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的磷酸腺苷（cAMP）濃度提高，細(xì)胞內(nèi)鈣數(shù)量增多，心肌收縮力增強(qiáng)，心肌排血量增加。在臨床上起到很好的治療效果。其藥理作用還有：①奧普力農(nóng)可以保護(hù)心臟，健康成年人靜脈給予1.25～50.00 μg/kg鹽酸奧普力農(nóng)藥動(dòng)學(xué)呈線性變化，給藥劑量與血藥濃度之間基本上成比例關(guān)系，能起到很好地保護(hù)心臟的作用。②擴(kuò)張血管，給予鹽酸奧普力農(nóng)后腦血流、心輸出量明顯增加，提示鹽酸奧普力農(nóng)具有明顯擴(kuò)張腦血管的作用?？梢娫撍幬镞€具有增加腦代謝的作用，未來(lái)可以作為新藥研究用于治療腦血管痙攣引起的偏頭痛等癥狀。③對(duì)于呼吸系統(tǒng)的影響，能擴(kuò)張支氣管，增加cAMP產(chǎn)生支氣管擴(kuò)張作用，緩解支氣管平滑肌痙攣，起到治療支氣管哮喘的作用。④抗炎作用，冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后給予鹽酸奧普力農(nóng)，具有促炎作用，使抗炎作用經(jīng)體外循環(huán)后達(dá)到高峰，說(shuō)明該藥物具有一定的抗炎作用。⑤器官保護(hù)作用，減輕或消除缺血-再灌注損傷（IRI）是近些年來(lái)臨床面臨的重大研究課題之一。通過(guò)減少細(xì)胞因子表達(dá)，減輕炎癥程度，從而起到對(duì)損傷器官的保護(hù)作用。然而事物都具有相對(duì)的兩個(gè)方面，有好的方面，同樣也有不利因素存在。鹽酸奧普力農(nóng)注射液對(duì)于肥厚型梗阻性心肌病患者禁用，使用后會(huì)加重狹窄影響心肌輸出量，使病情進(jìn)一步加重。下列情況疾病也要謹(jǐn)慎使用，如嚴(yán)重的快速型心律失?；颊摺⒛I功能受損患者和嚴(yán)重的低血壓患者，使用本品后會(huì)引起原有的疾病加重，提示上述這些疾病臨床上慎重使用。

4.4 鹽酸奧普力農(nóng)注射液今后的發(fā)展前景

隨著心、腦血管病診療技術(shù)的不斷提高，許多在急性期死亡率極高的疾病如急性心肌梗塞，由于采用了擴(kuò)張血容量和溶栓等治療手段，使死亡率明顯降低，可是由此引起心力衰竭的發(fā)病率確在逐年增多。還有隨著人類壽命不斷地延長(zhǎng)，心肌老化也已經(jīng)成為引起心力衰竭發(fā)生的重要原因。心衰已成為21世紀(jì)人類面臨的最難以攻克的頑固性疾病之一。當(dāng)臨床上出現(xiàn)心力衰竭癥狀時(shí)，必將是冠心病、高血壓、腦梗引起死亡的最后致命癥狀，隨時(shí)都有生命危險(xiǎn)，心衰的死亡率非常之高，有統(tǒng)計(jì)結(jié)果[14]表明，重度心衰患者死亡率高達(dá)50%，心衰患者得病2年后死亡率高達(dá)30%～40%，患病時(shí)間越長(zhǎng)，復(fù)發(fā)的幾率就越高，就需要反復(fù)住院治療，這樣周而復(fù)始，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量和生活質(zhì)量。根據(jù)2000—2001年亞洲心血管病國(guó)際合作研究中國(guó)部分的研究結(jié)果顯示我國(guó)心力衰竭患者已高達(dá)400萬(wàn)。而國(guó)內(nèi)藥品能治療心力衰竭的品種尤其甚少，只有魯南制藥廠生產(chǎn)的米力農(nóng)注射液一個(gè)品種，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)的需求，這也是本文著手研究制定注射劑安全性標(biāo)準(zhǔn)的目的所在，早研究早出結(jié)果，早點(diǎn)解除患者的痛苦。

表4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

由此可見鹽酸奧普力農(nóng)注射液上市后，能緩解市場(chǎng)供需緊張的問(wèn)題，會(huì)有很好的市場(chǎng)前景和發(fā)展空間。