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    Ⅰ群禽腺病毒分離鑒定及penton基因序列分析

    2021-05-10 16:35:55王彩先陸冰洋劉華棟李婷婷唐娟丁樹榮
    中國動物保健 2021年1期
    關(guān)鍵詞:分離鑒定

    王彩先 陸冰洋 劉華棟 李婷婷 唐娟 丁樹榮

    摘要:為調(diào)查山西省Ⅰ群禽腺病毒感染狀況,2018—2020年從山西各地區(qū)雞場采集樣品204份,通過SPF雞胚傳代增殖,設(shè)計檢測引物及penton基因全序列引物,經(jīng)PCR鑒定,選取陽性毒株進(jìn)行免疫瓊脂擴(kuò)散試驗、致細(xì)胞病變和雞胚致病性試驗。結(jié)果顯示:60份為Ⅰ群禽腺病毒陽性,陽性率為29.4%(60/204),從60份陽性Ⅰ群禽腺病毒中選取8株病毒與Ⅰ群禽腺病毒陽性血清反應(yīng),均呈現(xiàn)陽性;并且都可以導(dǎo)致雞胚肝細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化,增強(qiáng)其折光性;雞胚試驗可致雞胚發(fā)育不良或致死,有明顯病變發(fā)生。將克隆的8株penton基因進(jìn)行序列分析比對及遺傳進(jìn)化分析,顯示與Ⅰ群禽腺病毒血清1型和血清4型親緣關(guān)系最近,同源性高達(dá)99.6%~100%,其中6株為血清1型,2株為血清4型;與Ⅰ群禽腺病毒其它血清型同源性達(dá)72.0%~75.8%,與Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒同源性為49.0%~52.8%。研究提示,Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于養(yǎng)殖群體中,應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對Ⅰ群禽腺病毒的檢測和免疫,防治其它傳染病的繼發(fā)感染,以提高動物生產(chǎn)的安全。

    關(guān)鍵詞:Ⅰ群禽腺病毒;分離鑒定;penton基因

    禽腺病毒(fowl adenovirus,F(xiàn)AdV)歸屬于腺病毒科腺病毒屬,Ⅰ群禽腺病毒為線狀雙鏈DNA病毒[1-3],具有共同的抗原,禽腺病毒顆粒呈球形,具有12個定點,直徑為70~90nm,無囊膜,呈20面體對稱結(jié)構(gòu),由纖突(faber)、芯髓(cora)、衣殼(capsid)及相關(guān)蛋白構(gòu)成表面的252個殼粒,殼粒可以分成六鄰體(hexon)、五鄰體(penton),每個五鄰體連接兩根纖毛(fiber-1、fiber-2)[4-9]。其中penton所在的頭節(jié)區(qū)能夠識別細(xì)胞表面的病毒受體,在病毒入侵細(xì)胞的過程中起著非常重要的作用[10]。Ⅰ群禽腺病毒包括傳統(tǒng)的禽腺病毒及其他禽類分離物,可以水平傳播、垂直傳播、污染雞胚。該病多數(shù)呈隱性感染,在動物體內(nèi)復(fù)制不發(fā)病,當(dāng)動物抵抗力降低時隨同其他疾病共同發(fā)病,且影響動物免疫功能。近年出現(xiàn)其他Ⅰ群禽腺病毒具有強(qiáng)致病性,死亡率可達(dá)60%[11-13]。

    本試驗對采集樣品進(jìn)行免疫瓊脂擴(kuò)散試驗、血凝試驗、致細(xì)胞病變和雞胚致病性試驗及PCR檢測,對病毒penton基因序列進(jìn)行分析比對。根據(jù)該基因建立起來的PCR診斷方法可用于Ⅰ群禽腺病毒的鑒定。

    1材料與方法

    1.1材料及試驗動物

    SPF雞胚,購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司,雛雞均由SPF雞胚孵化;Ⅰ群禽腺病毒、減蛋綜合征(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽流感H9亞型(AIV-H9)、禽傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)陽性血清和SPF雞陰性血清由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院提供。

    1.2主要試劑

    E.coli DH5α菌株、病毒基因組DNA抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、DMEM、胎牛血清,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;pMD18-T克隆載體、Premix Taq,購自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.3病毒的分離

    取采集樣品,60Hz、10min研磨,反復(fù)凍融3次后,6,000r/min離心5min,取上清液過0.22μm濾菌器。采用尿囊腔接種法接種于9~10日齡SPF雞胚,每枚SPF雞胚接種200μL,棄24h內(nèi)死亡雞胚,溫育120h,將全部SPF雞胚放入4℃、6h,收獲尿囊液,連續(xù)3次傳代后收集的尿囊液用于DNA提取,提取方法參照病毒基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.4引物設(shè)計

    根據(jù)GeneBank公布的FAdV-4中hexon和penton基因序列[14,15],設(shè)計hexon檢測引物,分別是text-F/text-R,預(yù)期片段大小為421bp;設(shè)計penton的測序引物,分別是penton-1F/penton-1R,預(yù)期片段大小為1,834bp,penton-4F/penton-4R,預(yù)期片段大小為1,759bp,引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

    1.5樣品PCR檢測

    PCR擴(kuò)增體系(總體積為25μL):Premix Taq 20μL,DNA模板3μL,text-F/text-R各1μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性10min;95℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,共30個循環(huán);72℃再延伸10min。取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    1.6 penton基因的克隆

    1.5中PCR檢測為禽腺病毒陽性的毒株中,選取8株進(jìn)行PCR,擴(kuò)增體系(總體積為25μL):Premix Taq 20μL,DNA模板3μL,上下游引物各1μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性10min;95℃變性 30s,55℃/56℃退火 30s,72℃延伸 30s,共 30 個循環(huán);72℃再延伸 10min。取 5μ L PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收,將膠回收產(chǎn)物連接 pMD18-T 克隆載體,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5α ,經(jīng) 37℃培養(yǎng) 24h 后,挑取單菌落,經(jīng) PCR 鑒定,陽性菌送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行基因測序,測序結(jié)果使用 DNAstar 進(jìn)行序列比對,并構(gòu)建進(jìn)化樹。

    1.7 免疫瓊脂擴(kuò)散試驗

    經(jīng) 1.5 中 PCR 鑒定為陽性的禽腺病毒毒株中,選取8 株不同年份的禽腺病毒毒株,制備抗原,按照常規(guī)方法進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗,用Ⅰ群禽腺病毒陽性血清與 8 株禽腺病毒抗原互相作用,Ⅰ群禽腺病毒陽性血清與減蛋綜合征(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽流感 H9 亞型(AIV-H9)、禽傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)陽性血清和 SPF 雞陰性血清互相作用為對照

    1.8 SPF雞胚肝細(xì)胞制備及病變

    按照制備原代雞胚肝細(xì)胞方法將 15~16d SPF 雞胚的肝組織用 0.25%胰酶消化,以含10%胎牛血清的DMEM作為培養(yǎng)基,放置在 CO2 培養(yǎng)箱中以 37℃,5%CO2 培養(yǎng),經(jīng)培養(yǎng)長成至單層后,取 2mL 分離上清液接種 SPF 雞胚肝細(xì)胞,經(jīng)2h 感染后棄去分離物,加入 20mL 5%胎牛血清維持液,同時設(shè)置未接種分離物SPF雞胚肝細(xì)胞為陰性對照,12h 后觀察培養(yǎng)情況,以后每3h 觀察一次。

    1.9 雞胚致病性試驗

    8株禽腺病毒分離物上清液分別接種9~10d SPF雞胚48枚,每株6枚,每枚SPF雞胚接種200μL設(shè)置空白對照6枚。37℃孵育培養(yǎng),分別于72h、96h、120h觀察雞胚的生長情況和病變情況。

    2結(jié)果與分析

    2.1樣品PCR檢測

    經(jīng)病毒基因組DNA提取試劑盒提取盲傳3代增殖尿囊液的DNA,經(jīng)PCR鑒定,在204份樣品中,60份為Ⅰ群禽腺病毒陽性,陽性率為29.4%(60/204),部分樣品的PCR結(jié)果見圖1。

    2.2 penton基因的克隆

    分別以8株陽性禽腺病毒上清液提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均能擴(kuò)增出1,736bp片段,與預(yù)期目標(biāo)相符,陰性對照pMD-18T載體質(zhì)粒中未能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶,PCR結(jié)果見圖2。

    2.3 penton基因的序列比較和進(jìn)化樹分析

    使用DNAStar軟件對8株1,759bp的penton基因序列進(jìn)行分析。其中FAV-01和FAV-03與Ⅰ群禽腺病毒血清4型同源性分別為100%與99.8%,其余6株陽性禽腺病毒毒株與Ⅰ群禽腺病毒血清1型同源性為99.6%~99.9%,所有的8株陽性禽腺病毒毒株與Ⅰ群禽腺病毒其他血清型同源性為72.0%~75.8%,與Ⅱ群禽腺病毒HEV(Turkey adenovirus 3 strain CA-AB)的同源性為49.0%~50.4%,與Ⅲ群禽腺病毒EDSV(Duck adenovirus 1 strain D11-JW-012)的同源性為50.9%~52.8%,見圖3。

    遺傳進(jìn)化樹分析顯示,F(xiàn)AV-01與FAV-03與Ⅰ群禽腺病毒血清4型親緣關(guān)系最近,其余6株陽性禽腺病毒毒株與Ⅰ群禽腺病毒血清1型親緣關(guān)系最近,所有的8株陽性禽腺病毒毒株與Ⅰ群禽腺病毒其他血清型親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn),與Ⅱ群禽腺病毒HEV和Ⅲ群禽腺病毒EDSV屬于不同進(jìn)化分支,親緣關(guān)系最遠(yuǎn),見圖4。

    2.4瓊脂擴(kuò)散試驗結(jié)果

    8株陽性禽腺病毒上清液與Ⅰ群禽腺病毒陽性血清均出現(xiàn)特異性白色沉淀帶,而減蛋綜合征(EDSV)、新城疫病毒(NDV)、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽流感H9亞型(AIV-H9)、禽傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)陽性血清和SPF雞陰性血清均不能與Ⅰ群禽腺病毒陽性血清產(chǎn)生特異性白色沉淀帶。

    2.5細(xì)胞病變結(jié)果

    8株陽性禽腺病毒上清液接種SPF雞胚肝細(xì)胞,雞胚肝細(xì)胞12h后逐漸開始出現(xiàn)變圓、皺縮,24h后集聚成堆、脫落、遮光性增強(qiáng)、細(xì)胞間距增大,呈拉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的病變特征;而對照組的雞胚肝細(xì)胞無相似病變特征。

    2.6雞胚致病性試驗

    8株陽性禽腺病毒上清液接種SPF雞胚后72h無死亡產(chǎn)生,每株禽腺病毒4℃冷凍2枚,共計16枚可觀察到全部SPF雞胚均出現(xiàn)尿囊液渾濁,有大量尿酸鹽產(chǎn)生,部分胚胎發(fā)育不良,呈侏儒胚,有出血癥狀,肝臟無明顯病變,絨毛尿囊膜增厚,陰性對照胚體發(fā)育正常無病變;96h后無死亡產(chǎn)生,每株禽腺病毒4℃冷凍2枚,共計16枚,病變情況與72h相似,出血雞胚組織松軟,取出時容易撕開斷裂;120h有1枚SPF雞胚死亡,觀察剩余16枚雞胚,病變情況與72h相似,死亡雞胚出現(xiàn)溶解樣病變,肝臟呈土黃色無出血點。各階段對照組SPF雞胚均發(fā)育正常。

    3討論

    Ⅰ群禽腺病毒對禽類的致病性主要引起的疾病有心包積液綜合征(HPS)和包涵體肝炎(IBH)[16,17],本試驗從采集的204份樣品中,經(jīng)SPF雞胚傳代增殖及PCR鑒定,確定60份樣品為Ⅰ群禽腺病毒陽性,陽性率為29.4%(60/204),可見Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于健康雞群中,呈現(xiàn)感染率較高,并且發(fā)病率低于感染率。Ⅰ群禽腺病毒感染雞群通常沒有明顯的臨床癥狀,并且可以垂直傳播。但是根據(jù)Ⅰ群禽腺病毒毒力的不同也可引起包肝炎和心包積液綜合征,主要臨床表現(xiàn)為心包腔內(nèi)充滿大量黃色透明液體或膠胨狀物質(zhì),肝臟腫大出血,脾臟腫大出血,腎臟腫大出血伴有尿酸鹽沉積,腺胃和肌胃交界出血,偶有肺臟出血發(fā)生。

    由于Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于健康禽類之中[18],如雞、鴨、鵝等,卻不表現(xiàn)明顯的致病特征和臨床癥狀,極易在養(yǎng)殖生產(chǎn)中被忽略,由于該病垂直傳播,隱性污染雞胚的可能性被提高,加之部分生物制品中仍無法完全使用SPF雞胚或者是免疫雞胚,在生產(chǎn)過程中依賴非免疫雞胚,使得Ⅰ群禽腺病毒污染生物制品的情況發(fā)生,嚴(yán)重影響胚源生物制品的質(zhì)量。

    8株陽性Ⅰ群禽腺病毒毒株經(jīng)序列同源性比較和進(jìn)化樹分析,penton基因與已報道的Ⅰ群禽腺病毒血清1型和血清4型序列同源性達(dá)99.6%~100%,與其他Ⅰ群禽腺病毒血清型同源性達(dá)72.0%~75.8%,與Ⅱ群禽腺病毒HEV同源性為49.0%~50.4%,與Ⅲ群禽腺病毒EDSV同源性為50.9%~52.8%;進(jìn)化樹分析確定8株陽性毒株其中6株陽性與Ⅰ群禽腺病毒血清1型接近,2株陽性與血清4型接近,8株陽性與Ⅰ群禽腺病毒其他血清型較遠(yuǎn),而與Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒親緣關(guān)系最遠(yuǎn),屬于不同的進(jìn)化支,表明8株陽性毒株均歸屬于Ⅰ群禽腺病毒。

    Ⅰ群禽腺病毒雖然只有少數(shù)血清型能夠引起明顯發(fā)病,但當(dāng)雞群受到其他禽類傳染病的侵害時可以產(chǎn)生協(xié)同作用,如雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)和雞傳染性貧血病毒(CIAV)[19-21],可使條件性致病源發(fā)生快速感染,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受到侵害,引起產(chǎn)蛋下降、再生障礙性貧血和死亡等癥狀,應(yīng)當(dāng)對Ⅰ群禽腺病毒予以重視,防止大規(guī)模疾病發(fā)生。

    4結(jié)論

    本試驗分離到60株FAV,多數(shù)陽性毒株采集于無癥狀雞群,表明FAV在雞群中呈陰性感染狀態(tài),應(yīng)當(dāng)采取血清學(xué)檢測或者是分子生物學(xué)檢測,以指導(dǎo)雞場采用疫苗或者淘汰的方法進(jìn)行凈化,經(jīng)PCR鑒定及序列測定毒株仍未有更詳盡的研究,將會對其進(jìn)行更深入的探討。█

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