一株鴨疫里默氏桿菌RA-T株的分離鑒定

劉霞

摘要：2020年9月山東濱州某鴨場內雛鴨陸續(xù)發(fā)病死亡，根據發(fā)病情況初步分析是鴨傳染性漿膜炎。經過臨床診斷和實驗室檢測最終確診為鴨疫里默氏桿菌感染，經過積極治療，疫情得到有效控制。本研究對該發(fā)病鴨場病料開展了實驗室相關檢驗，并成功保存一株命名為RA-T的鴨疫里默氏桿菌。

關鍵詞：鴨；鴨疫里默氏桿菌；RA-T株

鴨傳染性漿膜炎俗稱鴨疫等，是養(yǎng)鴨業(yè)中常發(fā)的一種細菌類傳染性疾病，其致病菌為鴨疫里默氏桿菌。研究發(fā)現鴨疫里默氏桿菌的血清型眾多，有21種，但不同血清型之間缺乏交叉保護。當前鴨疫里默氏桿菌病是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的細菌性疾病之一，該病在全世界范圍內流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經濟損失。我國鴨疫里默氏桿菌病也很嚴重，已有研究報道的血清型多達10種以上，在養(yǎng)鴨過程中對鴨疫里默氏桿菌病的防治存在一定的困難。該病在世界范圍內廣泛流行，隨著季節(jié)交替，早晚溫差加大，使得近期鴨場各類疾病突增，尤其以鴨疫里默氏桿菌病發(fā)病率升高最為明顯。2020年9月，山東某鴨場鴨群突然發(fā)病，病鴨精神萎靡，不愿走動，眼鼻有漿液性分泌物，下痢且糞便呈黃綠色，瀕死鴨多表現頭向后背、兩腳伸直、搖頭等神經癥狀，發(fā)病率和死亡率日益增多。對病死鴨剖檢可見肝臟、心臟表面有灰白色纖維素性滲出物覆蓋，腦膜充血，氣囊壁增厚，呈纖維素性氣囊炎。結合臨床癥狀及病理變化初步診斷為鴨疫里默氏桿菌病。本文主要介紹了此次診治過程的實驗室研究內容，以期對其他類似病癥的檢驗給與幫助。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集山東濱州某規(guī)模養(yǎng)鴨場中病死鴨的鴨頭。

1.1.2主要試劑天津康源生物科技有限公司的新生牛血清（批號：20190718），TSA培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司購買的生化發(fā)酵管和藥敏片，含5%牛血清的TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基。鴨疫里默氏桿菌PCR檢測引物：RA-F：GACTATACAGGTCTTACGTTCCCTGT，RA-R：TAACTGAGATGGGTTAACACCTCTAGC。

1.2方法

1.2.1病料細菌分離及純化將采集的病料組織分別劃線接種到麥康凱和含5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，麥康凱培養(yǎng)基放置在恒溫培養(yǎng)箱中，TSA培養(yǎng)基放置在厭氧罐里，37℃培養(yǎng)18h。然后挑取典型的單個菌落劃線接種到5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h。

1.2.2菌體染色及鏡檢將分離菌的純培養(yǎng)物采用革蘭氏染色的方法進行染色，并在1，000倍的油鏡下進行鏡檢觀察，記錄菌體的形態(tài)和染色特性。

1.2.3 PCR擴增取疑似鴨疫里默氏桿菌分離菌作為PCR模板，PCR體系為：10μL 2×Taq PCR Master Mix，1μL模板，RA-F 0.5μL，RA-R 0.5μL，補無菌H2O至總體積20μL，同時設立陰性對照組；運行程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。PCR反應后取10μL擴增產物加入到1.5%瓊脂糖凝膠加樣孔中，電泳約25min后，在凝膠成像儀上照相觀察。

1.2.4生化試驗按照常規(guī)方法，對可疑菌純培養(yǎng)物分別接種葡萄糖、蔗糖、乳糖、肌醇、過氧化氫及尿素等微量生化鑒定管，然后將各微量生化鑒定管放置到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，觀察結果。

1.2.5藥敏試驗將分離菌純培養(yǎng)物均勻涂布在含4%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，再分區(qū)平貼上卡那霉素、利福平、氨芐西林、鏈霉素、青霉素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑、頭孢氨芐、阿奇霉素、阿莫西林、新霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、多粘菌素B、頭孢噻肟共計18種常用藥敏片，在37℃厭氧罐里培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈的有無及直徑大小。

1.2.6分離菌株毒力試驗14日齡健康雛鴨10只，分成兩組：試驗組和對照組，5只/組。試驗組雛鴨通過頸部皮下接種0.2mL菌液，含菌量為1×108CFU，對照組雛鴨不做處理。將兩組雛鴨分別隔離飼養(yǎng)10d。同時觀察各組雛鴨健康情況，如有死鴨需解剖觀察病理變化并進行細菌分離。

2結果

2.1分離純化

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上沒有菌落生長；在含5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上出現圓形突起、邊緣整齊、不溶血的露珠樣菌落，直徑約1.5～2mm。斜射光下可呈現淡綠色熒光。

2.2鏡檢

典型菌落進行革蘭氏染色鏡檢，可見分離菌為無芽胞的陰性桿菌，兩端鈍圓，多數單個存在，也有少數兩個排列或呈短鏈排列的形態(tài)。與鴨疫里默氏桿菌鏡檢特征相符。

2.3生化試驗

該分離菌株與糖類和醇類反應為陰性，可見不與糖類和醇類發(fā)生反應，但能夠與過氧化氫和尿素發(fā)生反應，結果呈陽性。由此可見該分離菌株的生化特性與鴨疫里默氏桿菌相近。

2.4 PCR結果

電泳結果顯示，以分離菌株為模板獲得的片段大小與預期的鴨疫里默氏桿菌目的片段一致，由此可確定該分離菌為鴨疫里默氏桿菌，將其命名為RA-T。

2.5藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示分離株對磺胺異惡唑、頭孢氨芐高度敏感，對利福平、丁胺卡那、頭孢噻肟中度敏感，對新霉素、多黏菌素B低度敏感，其余11種均不敏感。

2.6動物回歸試驗結果

試驗組雛鴨攻毒24h后陸續(xù)出現精神倦怠，呆立不動，蜷縮在角落，食欲下降，拉綠色或灰黃色稀便，頭向后背、兩腳伸直等癥狀，48h內全部死亡。對照組雛鴨未見異常，健康生長。24h內死亡鴨解剖后病變不明顯，48h死鴨可見心臟、肝臟表面均有明顯的纖維素樣滲出。取病死鴨的鴨頭及肝臟進行細菌分離，均可以分離到鴨疫里默氏桿菌。

3討論

本研究根據臨床癥狀、病理剖檢，并結合細菌分離培養(yǎng)、生化試驗及PCR檢測等實驗操作，成功從山東省某養(yǎng)鴨場病死鴨腦組織中分離出了1株鴨疫里默氏桿菌。本試驗選用18種常規(guī)用藥進行藥敏試驗，結果顯示該分離株對不同藥物的敏感程度有所差異，耐藥性也比較嚴重，分析原因可能與日常養(yǎng)殖過程中抗生素的長期不合理使用有關。在臨床防治鴨疫里默氏桿菌時，根據藥敏試驗結果合理選用藥物，同時交替使用2～3種敏感藥物，不僅可以取得良好的治療效果，也可以避免藥物耐藥性的產生。隨著人們對食品安全的重視，養(yǎng)鴨業(yè)中抗生素的使用逐漸受到限制。耐藥性分析是在防控中用藥治療的依據，合理規(guī)范使用抗菌素在一定程度上可以避免耐藥性的產生。因此在鴨疫里默氏桿菌病臨床診治中進行分離鑒定和對其藥敏性的研究至關重要。

調查發(fā)現隨著天氣逐漸變涼，晝夜溫差加大，近期鴨場多種疫病發(fā)病率持續(xù)升高。鴨疫里默氏桿菌病的發(fā)病與鴨場衛(wèi)生條件狀況及飼養(yǎng)方法有很大關系，該養(yǎng)殖場內養(yǎng)殖密度過大，加之近期陰雨天氣的影響，地面潮濕，通風差，進而導致了此次疫情的發(fā)生。從病料分離的致病菌來看，鴨疫里默氏桿菌病發(fā)病率約占74%。由于鴨疫里默氏桿菌病、大腸桿菌病兩者在剖檢變化等方面極為相似，應予以區(qū)別。通常大腸桿菌病不出現全身抽搐、角弓反張等神經癥狀，剖檢后腸道病變更明顯，兩者都可以形成肝臟表面的纖維素滲出物，但鴨疫里默氏桿菌病形成的更薄、更干燥、更易剝離。

鴨疫里氏桿菌病對養(yǎng)鴨業(yè)危害極大。惡劣的飼養(yǎng)環(huán)境、不科學的養(yǎng)殖方式是誘發(fā)鴨疫里氏桿菌病的重要因素，因此在養(yǎng)殖過程中，一定要加強飼養(yǎng)管理，采取合理的飼養(yǎng)密度，保持適宜的溫濕度，保持空氣的充分流通，一旦發(fā)病，及時隔離診治。目前預防鴨疫里氏桿菌最有效的方法是科學制定免疫程序，選用安全有效的疫苗，對鴨群接種鴨疫里氏桿菌類疫苗，使鴨群產生免疫抗體，來抵御疾病的發(fā)生。鴨疫里氏桿菌油佐劑滅活疫苗免疫9日齡左右雛鴨，免疫14d后對鴨群進行二免，通常免疫效果較好。█