江蘇1株雞傳染性貧血病毒的分離鑒定

杜宗沛等

摘要：利用MDCC-MSB1細(xì)胞系從江蘇省泰州市發(fā)病雞中分離獲得1株病毒，通過間接熒光抗體試驗（IFA）確定該病毒為雞傳染性貧血病毒（CAV）。利用PCR擴增、電泳、克隆、核酸測序得到全長2 324 bp的基因編碼區(qū)序列，該序列堿基完整，無缺失和插入。經(jīng)遺傳學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，該株序列與GenBank中已收錄的可見CAV序列同源性為96.5%～99.8%。CAV的3個編碼基因序列VP1（1 315 bp）、VP2（643 bp）、VP3（366 bp）均有不同程度變異，以VP1變異程度最大。使用電子顯微鏡觀察到病毒粒子與雞傳染性貧血病毒一致，證實該病毒為雞傳染性貧血病毒新亞型，將其命名為CAV MY1305-30株并提交至GanBank，編號為KF318725、KF318726。

關(guān)鍵詞： 雞；傳染性貧血病毒；分離鑒定；基因序列；編碼

中圖分類號： S855.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0244-03

雞傳染性貧血?。–hicken infectious anemia，CIA）最早被稱為貧血綜合征、貧血-皮炎綜合征、出血性貧血病、貧血因子病等，其病原于1979年被首次分離并確定，早期稱其為雞貧血因子（chicken anemia agent，CAA）、雞傳染性貧血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV），之后逐漸統(tǒng)一稱作雞貧血病毒（chicken anemia virus，CAV）。CAV的核酸為環(huán)狀單股負(fù)鏈DNA，在1995年第6次國際病毒分類大會上將其與豬圓環(huán)病毒（PCV）、長尾鸚鵡啄羽病病毒（PBFDV）一起歸屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae），該科病毒是已知最小的動植物病毒，因此很少有人能通過電子顯微鏡觀察到CAV。從CAV感染的MDCC-MSB1（雞馬立克氏病成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系）細(xì)胞培養(yǎng)液中純化的病毒粒子，經(jīng)負(fù)染后在電子顯微鏡下呈直徑約為20 nm的球狀。CAV對乙醚、三氯甲烷均有抵抗力；對酸（pH值為3）作用3 h后仍保持穩(wěn)定；對56 ℃下 120 min、70 ℃下60 min、80 ℃下15 min的處理均有抵抗力。雞傳染性貧血病的特征性病理變化為骨髓黃化和胸腺萎縮。發(fā)病雞骨髓中的紅髓組織被脂肪組織替代，呈黃色；胸腺嚴(yán)重萎縮，其大小僅為正常雞的1/10。雞傳染性貧血病廣泛流行于世界各地，呈垂直和水平傳播[1]。

1材料

1.1待檢樣品

1日齡雛雞來自江蘇省泰州市，用間接酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測其父母代種雞群血清，CAV陽性率高達(dá)87%。

1.2試劑和細(xì)胞

exTaq DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、dNTP、DL2 000 DNA Marker、酚氯仿異戊醇、蛋白酶K均購于大連寶生物工程有限公司；無水乙醇、三氯甲烷均購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；瓊脂糖購于上海英俊生物技術(shù)有限公司；EB替代物購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；工程菌DH5α、單克隆抗MDCC-MSB1細(xì)胞、CAV毒株陽性對照均由筆者所在實驗室保存與提供。細(xì)胞培養(yǎng)液配方為83% RPMI 1640、15%胎牛血清、1%雙抗、1%谷氨酰胺；細(xì)胞維持液配方為93% RPMI 1640、5%胎牛血清、1%雙抗、1%谷氨酰胺；細(xì)胞凍存液配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)液、30%～40%胎牛血清、10% DMSO。

2方法

2.1樣品的采集與處理

于江蘇省泰州市發(fā)生雞傳染性貧血病的某雞場采集 10～50 日齡的病雞或病死雞，在生物安全實驗室內(nèi)對其進(jìn)行剖檢，采集雛雞的肝、脾、胸腺等組織臟器，充分研磨后用滅菌生理鹽水制成懸濁液，加入終濃度為1 000 U/mL的雙抗，于37 ℃下感作60 min。將其反復(fù)凍融3次后進(jìn)行超聲波處理，將1 000 g離心4 min后取上清，于70 ℃水浴處理5 min，再經(jīng)體積分?jǐn)?shù)50%的三氯甲烷處理15 min，離心并取上清，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，置于-70 ℃保存待檢。其中一份用于PCR的初步檢測，另一份用于病毒的分離培養(yǎng)。

2.2回歸試驗

將分離毒株的第4代至第6代MSB1細(xì)胞培養(yǎng)物分別腹腔接種于1日齡SPF雞0.2 mL/羽。于接種后14 d迫殺，測定HCT值，并進(jìn)行病理剖檢及病理組織學(xué)檢查。

2.3MDCC-MSB1細(xì)胞培養(yǎng)分離

將含病毒樣品接種MDCC-MSB1細(xì)胞，每2～3 d盲傳1代，每日觀察細(xì)胞病變（CPE），當(dāng)70%～80%的細(xì)胞崩解或代謝停止時收毒[2]，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4免疫熒光染色試驗

取分離毒株細(xì)胞培養(yǎng)物和T K5803分別接種MDCC-MSB1細(xì)胞（3.0×105個/mL），于48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，以1 000 r/min離心5 min，將細(xì)胞沉淀用PBS洗3次并涂于載玻片，干燥后用冷丙酮固定10 min。接種1日齡SPF雞的組織切片，也按同樣方法固定后作為待測抗原，進(jìn)行間接免疫熒光染色，并用熒光顯微鏡觀察。

2.5分離毒株的CAV抗原檢測

將1株分離毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)超聲波破碎后離心，除去細(xì)胞碎片，用PEG濃縮后負(fù)染，進(jìn)行電子顯微鏡觀察。

2.6樣品的PCR初步檢測

2.6.1引物設(shè)計 根據(jù)已發(fā)表的CAV Cux-1、TR20等毒株的基因組序列設(shè)計并合成檢測引物，用于樣品的PCR檢測。擴增靶基因的理論長度為582 bp，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

2.6.2組織DNA的提取 采用蛋白酶K裂解法提取組織中的核酸，操作步驟如下：（1）取200 μL組織研磨液移至1.5 mL 的EP管中；（2）向EP管中依次加入300 μL PBS、5 μL 蛋白酶K、60 μL 10% SDS，于56 ℃水浴消化1 h后，至微波爐中高火處理1～2 min，使其透明澄清；（3）向各管加入等體積的酚氯仿異戊醇，以12 000 r/min離心10 min；（4）將上清液移至新的1.5 mL EP管中，重復(fù)步驟（3）；（5）取上清液并加入等體積三氯甲烷，以12 000 r/min離心10 min；（6）取上清液并加入2倍體積的無水乙醇、1/10體積的NaAc（3 mol/L），于室溫下靜置1 h后，以12 000 r/min離心 10 min；（7）棄上清并加入500 μL 70%乙醇，以12 000 r/min離心 15 min；（8）棄上清，干燥5 min后加入40 μL Elution Buffer使其溶解。

2.6.3PCR檢測 以病毒DNA為模板，用引物CAV-R、CAV-F 擴增所需目的基因。按反應(yīng)體系（表1）配制好后混勻并置于PCR擴增儀中，運行如下程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，結(jié)束后于4 ℃保存。

表1 PCR 25 μL反應(yīng)體系

組分 加入體積（μL/支）10×Buffer 2.5DNTP（2.5 mmol/L） 2.0引物CAV-R（20.0 mmol/L） 1.0引物CAV-F（20.0 mmol/L） 1.0rTaq酶 0.5ddH2O 15.5DNA模板（1 μg/μL）2.0合計25.0

2.6.4PCR擴增電泳操作步驟如下：（1）稱取1 g瓊脂糖，與100 mL的1×TAE緩沖液配成1%瓊脂糖溶液。（2）溶解后冷卻5～10 min，加入14 μL EB替代物并混勻。（3）架好梳子，倒入瓊脂糖溶液，靜置30 min使其凝固，移去梳子。（4）將PCR擴增產(chǎn)物與Loading Buffer緩沖液按 5 ∶1 的比例混勻，并將混勻后的液體加至電泳槽小孔中。（5）重復(fù)步驟（4），加入其他剩余PCR擴增產(chǎn)物。（6）選用DL2000的Marker，加至電泳槽小孔中。（7）接通電源，紅色為正極、黑色為負(fù)極，將電壓調(diào)至180 V。（8）電泳條帶至1/3位置時即可停止，電泳時間約為10～15 min。（9）使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝并保存。

3結(jié)果與分析

3.1 病毒的分離鑒定

感染CAV的MDCC-MSB1傳代細(xì)胞呈IFA陽性（圖1）。分離株CAV經(jīng)電子顯微鏡觀察，與以往發(fā)現(xiàn)的CAV結(jié)構(gòu)一致（圖2）。分離株與CAV陽性對照的電泳條帶處于同一點位（圖3）。

3.2序列測定結(jié)果

CAV MY1305-30株基因編碼區(qū)全長為2 324 bp，堿基完整，無缺失和插入。與國際基因庫中可見CAV序列進(jìn)行同源性、親緣關(guān)系的比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其同源性為96.5%～998%。CAV的3個編碼基因序列VP1（1 315 bp）、VP2（643 bp）、VP3（366 bp）均有不同程度變異，其中VP1的變異程度最大。

3.3核苷酸和氨基酸位點的改變

由VP1基因比對序列結(jié)果可知，MY1305-30屬于A3亞分支。在683位核苷酸中該點為T，而JAPAN-ABO46590則為G（圖4）。

3.4遺傳進(jìn)化關(guān)系分析

將CAV MY1305-30株基因與國際基因庫中可見CAV序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化比對分析，繪制遺傳進(jìn)化樹。CAV MY1305-30株VP1基因?qū)儆谝訫ajority為代表的基因群，與

A3 JAPAN AB046590.親緣關(guān)系最近；與C Australia AF227982.、C Australia EF683159.親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖5）。

CAV MY1305-30株基因VP2序列與印度的A1 India AY583756 CAV-B親緣關(guān)系最近，與澳大利亞的C Australia AF227982、C Australia EF683159親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖6）。

4結(jié)論與討論

基因序列分析對比表明，江蘇分離株CAV MY1305-30與其他32株CAV病毒編碼區(qū)的核苷酸基因同源性為96.5%～99.8%；與vp1.seq、B_JS-China_73.seq、A3 JAPAN AB046590.seq株相對比，VP1序列僅有1個堿基不同。單一比對VP1、VP2、VP3的生物開放閱讀框架（ORF），CAV MY1305-30與其他32株CAV毒株的核苷酸同源性分別達(dá)95.7%、99.1%、98.7%以上，表明該分離株變異不大，且CAV病毒本身變異很小。

由進(jìn)化樹分析結(jié)果可見，CAV VP1所對比的32個毒株分為兩大分支，各分支中均有亞洲、歐美的毒株存在，并無明顯的地域區(qū)分性。CAV VP2所對比的32個毒株也沒有明顯的地域區(qū)分性，兩大分支中各有亞洲、歐美的毒株存在。

參考文獻(xiàn)：

[1]Yassir M，Eltahir，et al. Molecular epidemiology of chicken anemia virusin commercial farms in China[J]. Virology Journal，2011，8：145-152.

[2]劉婉思，高宏雷，秦立廷，等. 1株野鴨源雞貧血病病毒的分離鑒定及其編碼區(qū)基因序列分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33（5）：654-658，679.李波，陳雪梅，李鐵緣，等. 2種不同抗旱性冰草葉片解剖結(jié)構(gòu)的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：247-249.