寧動顆粒對抽動-穢語綜合征模型大鼠行為學的影響

李夢盈，姜莉苑，李繼君

（1.衢州職業(yè)技術學院，浙江 衢州324000；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)學中心中西醫(yī)結合科，上海200127）

抽動穢語綜合征（tourette's syndrome，TS）是一種發(fā)育神經精神障礙，臨床上以面部、四肢、軀干等部位肌肉出現(xiàn)不自主、快速、無目的的反復抽動等刻板行為為主癥，少部分患兒可伴有喉部異常發(fā)聲、猥穢言語等癥狀的綜合癥候群。TS患兒常伴有多動、強迫等行為及情緒障礙，如注意缺陷多動障礙（ADHD）、強迫性障礙（OCD）、情緒障礙及其他自傷行為。部分患者抽動可導致終生疾患，約5%的患兒有生命危險癥狀，嚴重影響生活質量[1]。近年來，TS發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，因此，盡早選擇安全有效的治療方法具有重要意義。目前TS主要采用西醫(yī)藥物治療，其中氟哌啶醇、利培酮、硫必利等精神類藥物已成為治療TS的一線藥物，西藥能抑制患兒大腦皮質運動區(qū)的興奮性，發(fā)揮減輕抽動癥狀的效果。但氟哌啶醇服用后產生的不良反應與藥物干預劑量、時間密切相關，目前臨床上常見的不良反應包括帕金森樣震顫、嗜睡、坐立不安、頭痛、強迫性張口、斜頸、反復徘徊、伸舌、消化道癥狀等，導致患兒無法耐受，最終中斷治療。

寧動顆粒是李安源教授的經驗方[2-3]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，寧動顆?？捎绊慣S模型大鼠抽動刻板行為及學習記憶能力，其作用機制與抑制多巴胺（DA）系統(tǒng)的興奮性密切相關。本研究探究寧動顆粒對抽動-穢語綜合征模型大鼠行為學的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取清潔級雄性Wistar大鼠24只，由上海兒童醫(yī)學中心動物實驗中心提供，SPF級,合格證號：11401500007810，體質量（100±20）g，動物房室溫（23±2）℃，相對濕度45%～65%，采用12 h光照黑暗自動循環(huán)。將寧動顆粒（深圳三九中藥有限公司，批號：201603212）用蒸餾水稀釋為實驗所需的濃度后使用；氟哌啶醇（Hal，上海安心八福藥業(yè)有限公司，國藥準字H86749384，規(guī)格：2 mg/片）灌胃藥液配制：氟哌啶醇2 mg+0.9%氯化鈉溶液2 mL（將1片Hal研磨成細末，溶入2 mL 0.9%氯化鈉溶液），現(xiàn)配現(xiàn)用；阿樸嗎啡（Apo，美國Sigma公司，批號：079K6547）注射液配制：阿樸嗎啡1 mg+無菌生理鹽水1 mL，充分溶解后避光使用[6-7]。

1.2 方法

1.2.1 TS動物模型24只Wistar TS模型大鼠隨機分為阿樸嗎啡組（CTR，n=8）、氟哌啶醇組（Hal，n=8）和寧動顆粒組（NDG，n=8）。3組大鼠均腹腔注射阿樸嗎啡1.0 mg/（kg·d），連續(xù)注射藥物4周。在造模情況下，同時，進行藥物干預。CTR組給予等量蒸餾水；NDG組給予寧動顆粒370 mg/（kg·d）（相當于臨床用量的15倍）；Hal組給予氟哌啶醇10 mg/（kg·d）（相當于臨床用量的10倍）。各組大鼠均灌胃藥物干預，每天上午10：00藥物干預1次，藥物灌胃連續(xù)干預8周。

1.2.2 大鼠抽動刻板行為測試在給大鼠注射阿樸嗎啡及在干預治療15 min后，開始觀察大鼠的刻板活動，包括：咬、嗅、舔（不包含理毛）、挖洞、迅速移位、急速跳躍等。評分標準參照文獻[8]報道。評分方法：0分，無刻板運動；1分，動物鼻嗅增加，常伴有抬頭活動；2分，動物不連續(xù)地嗅增加，伴有身體抬高；3分，動物不連續(xù)地嗅增加，伴有頭和身體原地抬高運動的舔，偶然的快速的爆發(fā)性的自發(fā)活動（2～5步）；4分，動物連續(xù)地嗅、咬、舔、搖頭及反復的身體抬高、爬墻；5分，動物連續(xù)地嗅、咬、舔、搖頭及連續(xù)地身體抬高、爬墻，并伴有前爪不著地。

1.2.3 認知及其他行為測試①開場試驗：制一個底為60 cm×60 cm的正方形、高為40 cm的木箱，用線將箱子底部分為20 cm×20 cm的9個正方形小格子，在正式實驗前1天，將大鼠放進9個方格中最中央的格子內20 min以適應箱子的環(huán)境，從而減少大鼠因對環(huán)境陌生而產生焦慮不安的情緒，進而影響其正常的活動水平。正式實驗開始時，將每只大鼠放進最中央的格子內，通過攝像機對大鼠5 min內的實際活動情況進行行為攝像，刻錄成光盤后，通過盲法觀察和記錄大鼠在中央方格內停留的時間、大鼠直立次數(shù)、穿越格子的數(shù)量、梳理毛的次數(shù)。在每次大鼠測試結束后，清潔測試區(qū)域，同時，注意保持測試期間的噪聲及周邊光線亮度的一致性[9]。②Morris水迷宮實驗：迷宮是一個圓形恒溫的乳白色鐵制水池，直徑120 cm，高50 cm，按東、南、西、北4個方向將水池平均劃分為4個象限（NE、SE、SW、NW），再將直徑10 cm，高度為30 cm的圓形平臺放入迷宮水池中，注入乳白色不透明液體，使圓形平臺隱沒在水下2 cm，水溫（20±2）℃，平臺可置于任意一個象限中央。在正式實驗之前，在水池中不設立平臺，讓大鼠在池內自由游60 s，以消除焦慮適應新的環(huán)境。實驗第1～4天，連續(xù)4 d，將大鼠從4個不同的象限下水，通過拍攝記錄大鼠尋找并站到隱藏平臺所需的時間。若大鼠在120 s內找到平臺，則讓其在平臺上停留30 s，使大鼠觀察并記住空間的參照物。若大鼠在120 s內未能找到平臺，則由測試者引導上平臺，并同樣停留30 s。每天測試連續(xù)4次，當天的成績?yōu)?次的平均值，進而監(jiān)測大鼠的學習記憶能力[10-12]。

1.3 觀察指標觀察對4組大鼠行為學的影響。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，開場試驗采用單因素方差分析，Morris水迷宮采用一般線性模型的Repeated Measures ANOVA方差分析，比較用t檢驗，兩組間的相關性分析用雙變量相關行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TS模型大鼠抽動行為評估連續(xù)注射Apo 4周后大鼠出現(xiàn)持續(xù)且穩(wěn)定的刻板活動。藥物干預第5周，Hal組和NDG組與CTR組相比，大鼠刻板活動明顯減弱（P＜0.05），藥物干預第8周差異最大（P＜0.05），見表1。

表1 3組TS模型大鼠抽動行為比較（±s，次）Table 1 Comparison of the twitch behavior monitoring among three groups of TS model rats(±s,times)

表1 3組TS模型大鼠抽動行為比較（±s，次）Table 1 Comparison of the twitch behavior monitoring among three groups of TS model rats(±s,times)

注：與CTR組比較，aP＜0.05

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2.2 TS模型大鼠開場試驗中的行為表現(xiàn)NDG組干預8周后，大鼠在中央停留時間顯著增加（P＜0.05）；Hal組藥物干預前后大鼠在中央停留時間比較差異無統(tǒng)計學意義；干預8周后，NDG組穿格子次數(shù)減少，與CTR組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Hal組穿格子次數(shù)與CTR組比較差異無統(tǒng)計學意義；NDG組干預后，大鼠直立次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。Hal組藥物干預前后各項目比較差異無統(tǒng)計學意義；干預8周后，NDG組大鼠修飾次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。Hal組藥物干預前后比較差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

2.3 TS模型大鼠水迷宮試驗中的行為表現(xiàn)3組大鼠隨著多次重復練習，找到平臺的時間均減少，均低于第1天的時間（P＜0.05），且NDG組找到平臺的時間明顯低于Hal組和CTR組（P＜0.05），但Hal組和CTR組比較差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

表2 3組TS模型大鼠開場試驗行為表現(xiàn)比較（±s）Table 2 Comparison of the opening test among three groups of TS model rats(±s)

表2 3組TS模型大鼠開場試驗行為表現(xiàn)比較（±s）Table 2 Comparison of the opening test among three groups of TS model rats(±s)

注：與干預前比較，aP＜0.05

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表3 3組TS模型大鼠水迷宮行為表現(xiàn)比較（±s，min）Table 3 Comparison of morris water maze test among three groups of TS model rats(±s,min)

表3 3組TS模型大鼠水迷宮行為表現(xiàn)比較（±s，min）Table 3 Comparison of morris water maze test among three groups of TS model rats(±s,min)

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3 討論

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，TS大鼠出現(xiàn)連續(xù)穩(wěn)定不自主且快速的抽動刻板行為，這是由于Apo的誘導增強了黑質-紋狀體DA系統(tǒng)功能，從而誘導并增強了大鼠的刻板行為，連續(xù)注射Apo，進而使大鼠出現(xiàn)連續(xù)且穩(wěn)定的抽動行為，然后運用NDG及Hal對抽動模型大鼠進行治療，結果表明，治療組和非治療組在刻板行為方面有顯著性變化，兩組均能明顯減弱Apo誘導的TS模型大鼠抽動刻板行為，與CTR組相比，治療組抽動行為在抽動的持續(xù)時間、頻率及復雜程度均顯著減弱。提示NDG在治療TS抽動刻板效果與西藥Hal療效相當，但NDG安全性高于Hal。

臨床上患TS癥狀的患兒通常伴有學習困難問題，而智力水平的高低則直接影響患兒的學習成績。有文獻[13]報道發(fā)現(xiàn)，TS患兒的智力水平大多處于正?；蜻吘墵顟B(tài)，且即使TS患兒的智力水平在正常范圍內，但與正常兒童相比仍處于較差狀態(tài)。記憶是人腦對過去活動、感受、經驗的印象累積，通常分為長時記憶、短時記憶及瞬時記憶。有研究表明TS患兒的瞬時記憶和短時記憶可能存在一定程度的缺陷[14]。Bomtcin RA[15]對28例TS患兒采用Halsetad兒童神經心理成套量表測試，發(fā)現(xiàn)TS患兒的觸覺操作評分異常，提示TS患兒存在空間記憶能力缺陷。劉智勝等[16]采用韋氏兒童記憶量表對TS患者進行檢測，發(fā)現(xiàn)患兒總記憶商數(shù)雖在正常范圍，但在背數(shù)和視覺再生測驗結果明顯低于正常水平，提示抽動患兒的短時記憶存在缺陷。此外，背數(shù)異?？煞从郴純鹤⒁饽芰θ毕?，這可能與TS共患ADHD存在一定的相關性。本研究顯示，NDG干預可有效改善TS模型大鼠學習及記憶能力。

開場試驗是觀察多動行為再現(xiàn)使用最多的試驗，該試驗主要反映大鼠在陌生環(huán)境下自發(fā)活動能力，通常以大鼠直立次數(shù)、穿越格子數(shù)等指標反應其自發(fā)活動能力，大鼠格子數(shù)穿越次數(shù)多代表大鼠的水平活動越高，而直立次數(shù)可表示大鼠垂直活動水平能力，直立次數(shù)越多表示大鼠垂直活動水平越高。在開場實驗中，TS模型大鼠表現(xiàn)出多動、焦慮及激惹狀態(tài)，其在中央停留時間短，穿格子數(shù)、直立次數(shù)及修飾次數(shù)多。大鼠在NDG干預8周后，其在中央停留時間較藥物干預前明顯增加，說明NDG能有效改善TS模型大鼠焦慮及激惹等狀態(tài)，可能與NDG改善多巴胺系統(tǒng)紊亂有關；同時，NDG組穿越格子數(shù)、修飾次數(shù)和直立次數(shù)也隨之顯著減少。說明NDG能明顯改善TS模型大鼠多動及刻板的癥狀。

Morris水迷宮是測評學習記憶能力最經典的實驗，通過定位航行試驗反應其空間記憶的保持能力。每天從4個不同點將大鼠分別放入水中若干次，并記錄大鼠找到隱蔽在水下平臺所需要的時間。隨著訓練的增多，大鼠逐漸學會找到固定位置的平臺，進而形成對空間位置的認知。本研究結果顯示，在藥物干預8周后，3組大鼠隨著多次重復的練習期間，找到平臺的時間均減少，且與第1天找到平臺時間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明大鼠均有學習和記憶的能力，且NDG組找到平臺的時間更短，表明NDG改善TS模型大鼠學習和記憶能力強于Hal組和CTR組；Hal組找到平臺的時間與CTR組相比差異無統(tǒng)計學意義，說明Hal改善或者提高大鼠學習記憶效果顯著。提示TS大鼠存在學習記憶能力的缺陷，與臨床現(xiàn)象相符，NDG改善TS模型大鼠學習和記憶能力強于Hal。

綜上所述，寧動顆?？娠@著抑制TS模型大鼠抽動刻板行為，且可改善TS模型大鼠多動及學習記憶能力。