基于高通量測序技術(shù)分析微凍凡納濱對蝦的微生物

陶飛燕 ，潘 創(chuàng)，陳勝軍，胡 曉，鄧建朝，李春生，榮 輝，王悅齊

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室/國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300）

凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei) 是養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦品種之一[1]。根據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》[2]數(shù)據(jù)，凡納濱對蝦產(chǎn)量占海水養(yǎng)殖蝦的78.91%和淡水養(yǎng)殖蝦的21.29%。其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含人體必需氨基酸及鈣 (Ca)、鐵 (Fe)、鋅 (Zn) 等礦物元素[3]，是一種兼具營養(yǎng)價值與經(jīng)濟價值的高蛋白營養(yǎng)水產(chǎn)品，近年來國內(nèi)外對其需求逐漸上升[4]。然而，對蝦在貯藏和流通過程中，品質(zhì)容易劣變，其表面附著的微生物是造成其變質(zhì)的最根本因素。受生長環(huán)境、加工工藝、產(chǎn)品特征等因素的影響，凡納濱對蝦會形成自身獨有的菌相，數(shù)量及種類繁多[5-7]。在對蝦失去活力后，那些適合生存的微生物會利用蝦體內(nèi)豐富的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長繁殖，產(chǎn)生腐敗氣味，加速腐敗進程，嚴重影響產(chǎn)品的貨架期。因此對凡納濱對蝦進行菌相研究，找出貯藏過程中的優(yōu)勢微生物對控制其品質(zhì)具有重要意義。

對水產(chǎn)品微生物的研究以往多通過對菌株進行富集培養(yǎng)和分離純化，再根據(jù)形態(tài)、生理、生化等實驗得出結(jié)果，但結(jié)果往往不能完全反映樣品中微生物種類的真實情況[8]。近年來，隨著科技的進步，以DNA為基礎(chǔ)的宏基因組學(xué)技術(shù)取得較大進展。以高通量測序為主的宏基因組學(xué)技術(shù)是一種非培養(yǎng)分析法，無需對菌株進行培養(yǎng)，而是直接從樣品中提取出細菌的總DNA進行分析，能檢測到難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物[9]。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，宏基因組學(xué)技術(shù)能更完整地反映樣品中的微生物，達到鑒定微生物單一基因或全基因組的目的，且能同時對多個樣品進行分析，具有快速、高效等優(yōu)點[10-12]。如今高通量測序技術(shù)已成功應(yīng)用于多個領(lǐng)域，在各種水產(chǎn)品如牡蠣、小龍蝦上均有所應(yīng)用[13-14]。目前關(guān)于凡納濱對蝦在冷藏、冰溫過程中的菌相變化已有報道[15-17]，但是關(guān)于微凍貯藏以及凡納濱對蝦不同形態(tài)下表面微生物變化的研究還鮮有報道。本實驗以微凍的整蝦、去頭尾蝦和蝦仁為研究對象，采用Illumina HiSeq高通量測序技術(shù)分析不同貯藏時期的樣品微生物組成，進一步了解凡納濱對蝦在微凍貯藏期間的菌群變化規(guī)律，揭示其腐敗機理，為其貯藏保鮮研究提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

活凡納濱對蝦 (平均體長13.0 cm) 購于廣東省廣州市華潤萬家超市，于5～10 min內(nèi)快速運至實驗室進行處理。

SQ510C全自動高壓蒸汽滅菌器 (日本Yamato公司)；Sigma-3K30高速冷凍離心機 (德國Sigma公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺 (蘇州凈化設(shè)備有限公司)；THZ-C臺式恒溫振蕩器 (太倉華美生化儀器廠)；IN612C低溫恒溫培養(yǎng)箱 (日本Yamato公司)；Hiseq PE250測序儀 (美國Illumina公司)；Agilent 2 100生物分析儀 (美國Agilent科技公司)；實時熒光定量PCR儀 (美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與預(yù)處理 將凡納濱對蝦分成3組：完整對蝦、去頭尾蝦和蝦仁。每組設(shè)置3個平行組，于微凍 (?3 ℃) 環(huán)境下貯藏4周至完全腐敗。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果以1周為取樣時間間隔，分別在第0、第1、第2、第3和第4周取樣，進行表面微生物提取及測序。

1.2.2 蝦體表面微生物提取 在無菌操作環(huán)境下，將5組樣品及其平行組分別加入盛有無菌生理鹽水的無菌三角瓶中，室溫條件下在恒溫振蕩器中以300 r·min?1提取60 min，將蝦體表面微生物提取到無菌生理鹽水中。用無菌生理鹽水淋洗樣品3次，連同三角瓶中的液體一起轉(zhuǎn)移至滅菌后的離心管中，以 12 000 r·min?1離心 15 min，所獲得的菌液沉淀物于?80 ℃冰箱中貯藏，用于微生物菌落分析[18]。

1.2.3 DNA提取與PCR擴增 對蝦體的菌液沉淀物進行表面微生物的基因組DNA提取，通過1%瓊脂糖凝膠電泳測試樣品的完整性。取質(zhì)量合格的基因組DNA 30 ng，采用引物515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')對凡納濱對蝦菌體的16S rDNA基因V4可變區(qū)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：合格DNA 30 ng，PCR Primer Cocktail 4 μL，PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 補充至總體積50 μL。PCR的反應(yīng)條件設(shè)置為：98 ℃預(yù)變性3 min，30個循環(huán) (98 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸 45 s)；72 °C 終延伸 7 min。將擴增后的產(chǎn)物用AmpureXPbeads (AGENCOURT) 純化，溶于洗脫緩沖液中，貼上標簽，完成建庫。使用Agilent 2 100生物分析儀對文庫的片段范圍及濃度進行檢測，對檢測合格的文庫，根據(jù)插入的片段大小，選擇HiSeq平臺進行測序 (由深圳華大基因有限公司協(xié)助完成)[19]。

1.2.4 Illumina HiSeq測序數(shù)據(jù)處理及分析 將下機數(shù)據(jù)進行過濾，濾除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)(Reads)，將剩余的高質(zhì)量數(shù)據(jù)用于后期分析。通過軟件FLASH(Fast length adjustment of short reads, ver. 1.2.11)，利用reads之間的重疊關(guān)系將reads拼接成序列(Tags)。利用軟件Usearch (ver. 7.0.109 0) 將拼接好的Tags在97%的序列相似度下聚類成操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU)。根據(jù)聚類分析結(jié)果，計算得到趙氏指數(shù) (Chao)、艾斯指數(shù)(ACE)、香農(nóng)指數(shù) (Shannon)和辛普森指數(shù) (Simpson)，進行Alpha多樣性分析。其中，Chao和ACE指數(shù)用來表征樣品菌群豐富度，指數(shù)越大，豐富度越高。Shannon和Simpson指數(shù)表示菌群多樣性，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，多樣性越高[18,20]。通過RDP classifer (ver. 2.2) 軟件將OTU代表序列與Greengene數(shù)據(jù)庫比對，進行物種注釋，利用物種柱狀圖直觀展示各樣品的物種組成及比例，以及通過熱圖來反映樣品菌群組成的相似性和差異性等，分析不同貯藏時期的整蝦、去頭尾蝦和蝦仁的菌群結(jié)構(gòu)和變化規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物數(shù)量分析

采用Illumina HiSeq高通量測序?qū)ξ鰲l件下的凡納濱對蝦整蝦、去頭尾蝦和蝦仁3組樣品進行分析，通過拼接、過濾等對得到的原始數(shù)據(jù)序列進行處理。樣品測序覆蓋率作為測序準確性的指標，反映了測序結(jié)果能否代表樣品中微生物的真實情況。數(shù)值越高，樣品序列測出概率越高，測序結(jié)果越準確[21-22]。3組對蝦樣品的測序覆蓋率均超過0.998 (表1)，說明此次測序深度適合，數(shù)據(jù)可信，可進行樣品的微生物多樣性分析[23]。

表1 不同形式凡納濱對蝦的測序覆蓋率和操作分類單元數(shù)量Table 1 Coverage and OTU number of L. vannamei with different forms

根據(jù)各處理組在97%序列相似水平下的OTU生物信息統(tǒng)計，繪制了凡納濱對蝦的韋恩圖 (圖1)。整蝦、去頭尾蝦和蝦仁3組樣品的共有微生物達348種，而整蝦與去頭尾蝦之間共同微生物有461種，高出整蝦與蝦仁70種，說明整蝦與去頭尾蝦的物種相似度更高。由凡納濱對蝦蝦仁、去頭尾蝦和整蝦的OTU數(shù)量變化 (表1) 可知，隨貯藏時間延長，各組的OTU數(shù)量呈下降趨勢。其中，蝦仁的OTU數(shù)量在4周內(nèi)從最初的281降至31，去頭尾蝦從281降至54，而整蝦則是從316降至59。由以上結(jié)果可知，整蝦表面微生物種類相對更多，其次是去頭尾蝦，最后是蝦仁。凡納濱對蝦在去頭尾和去殼過程中明顯減少了部分微生物，且隨著微凍貯藏時間的延長，各組對蝦表面微生物減少的趨勢表明低溫對部分微生物的生長產(chǎn)生了抑制作用，該結(jié)果與鄧曉影等[10]對凡納濱對蝦微生物群落的研究結(jié)果一致。

圖1 不同形式凡納濱對蝦的韋恩圖R. 蝦仁樣品；Q. 去頭尾蝦樣品；Z. 整蝦樣品；后圖同此Figure 1 Venn diagram of L. vannamei with different formsR. Shrimp samples; Q. Decapitated shrimp samples;Z. Whole shrimp samples; the same below.

2.2 物種多樣性分析

Alpha多樣性常用于評價樣品中微生物菌群的豐富度和個體分配均勻性，以豐富度指數(shù)(Chao、ACE) 和多樣性指數(shù) (Shannon、Simpson) 為代表[24]。表2和表3反映了此次測序中凡納濱對蝦樣品的Alpha多樣性指數(shù)的變化趨勢。與新鮮的0周樣品相比，4周后的蝦仁、去頭尾蝦和整蝦的Chao和ACE指數(shù)均明顯減小 (表2)，說明對蝦表面的微生物種類隨貯藏時間的延長而減少，豐富度下降。其中，蝦仁中Chao和ACE指數(shù)整體低于其他兩組，說明蝦仁的去頭尾去殼制備過程對其表面的附著微生物組成具有較大影響，該結(jié)果與樣品的OTU數(shù)量分析結(jié)果一致。相比于蝦仁的持續(xù)下降趨勢，去頭尾蝦和整蝦的豐富度指數(shù)在微凍貯藏中期先增長后下降，可能是因為貯藏過程中優(yōu)勢腐敗菌屬繁殖使微生物數(shù)量增加，而繁殖產(chǎn)生的不良代謝物影響了其他菌種生長使多樣性降低。其次，微凍環(huán)境抑制部分微生物的生長使對蝦中微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著性變化[9]。各組凡納濱對蝦在貯藏期間Shannon指數(shù)下降和Simpson指數(shù)升高的趨勢(表3)，驗證了對蝦表面微生物的多樣性在貯藏期間逐漸降低的結(jié)論。這與曹榮等[8]對冷藏牡蠣微生物種類的研究結(jié)果較為相似，均表明在低溫貯藏過程中水產(chǎn)品中的微生物種類趨于簡化。

表2 不同形式凡納濱對蝦的Alpha豐富度指數(shù)表Table 2 Alpha abundance indices of L. vannamei with different forms

表3 不同形式凡納濱對蝦的Alpha多樣性指數(shù)表Table 3 Alpha diversity indices of L. vannamei with different forms

稀釋曲線由測序數(shù)量及其對應(yīng)的OTU數(shù)量構(gòu)建，可直接反映測序數(shù)量的合理性，并可通過物種變化趨勢間接評估樣品中的微生物物種豐度[19,25]。當(dāng)樣品測序數(shù)超過70 000時，其稀釋曲線趨于平緩 (圖2-a)，表明測序數(shù)量較合理，基本已覆蓋到樣品中的所有物種[26]。隨著測序數(shù)量的增加，Alpha多樣性的各指數(shù)稀釋曲線基本趨于平緩 (圖2-b、2-c、2-d、2-e)，驗證了測序的合理性，即測序數(shù)量已包含絕大多數(shù)微生物信息，足夠充分。

圖2 不同形式凡納濱對蝦多樣性指數(shù)的稀釋曲線Figure 2 Rarefaction curves of Alpha diversity indices of L. vannamei with different forms

2.3 不同分類水平上的物種注釋及分析

為獲得物種分類信息，使用Greengene數(shù)據(jù)庫對3組樣品序列進行物種注釋分析，并分別在目和屬水平上對微凍貯藏不同階段的樣品統(tǒng)計群落組成，選擇0周鮮樣、貯藏中期第2周和貯藏末期第4周的數(shù)據(jù)作物種柱狀圖 (圖3和圖4)。在目分類水平上 (圖3)，新鮮蝦仁的表面微生物主要是弧菌目、交替單胞菌目、氣單胞菌目和立克次氏體目，占菌群總量的88.52%。去頭尾蝦的主要菌群有弧菌目、交替單胞菌目、彎曲菌目和氣單胞菌目，總量占83.27%。其中，弧菌目豐度最高(40.62%)，交替單胞菌目次之 (20.34%)?；【恳彩钦r的優(yōu)勢菌種，其豐度占總菌群的23.29%，其次為交替單胞菌目 (20.41%)、黃桿菌目 (17.31%)、彎曲菌目 (10.13%) 和假單胞菌目 (8.84%)。有研究發(fā)現(xiàn)，新鮮牡蠣的優(yōu)勢菌群也是弧菌目和交替單胞菌目[19]，與本實驗結(jié)果相似。對比3組樣品的微生物組成，整蝦中黃桿菌目 (17.31%)、假單胞菌目(8.84%) 的相對豐度明顯高于去頭尾蝦 (5.49%,3.48%) 和蝦仁 (2.13%, 4.14%)，而弧菌目和氣單胞菌目豐度則遠低于其他兩組。貯藏2周后，整蝦、去頭尾蝦和蝦仁中的假單胞菌目相對豐度分別增至47.24%、29.77%和41.36%。研究表明，假單胞菌目為典型的嗜冷菌，可分解蛋白等大分子，產(chǎn)生氨臭味，是水產(chǎn)品低溫貯藏的主要腐敗菌[27]。此外，弧菌目明顯減少，可見該菌種低溫耐受性差，不能完全適應(yīng)微凍環(huán)境。除假單胞菌目外，交替單胞菌目的比例也在增加，蝦仁中占比達41.61%，成為貯藏第2周的優(yōu)勢菌種，而在去頭尾蝦中的相對豐度為21.61%，在整蝦中僅4.08%。推測此菌種也是致腐菌種之一，且對低溫的耐受性很好。在去頭尾蝦和整蝦樣品中，紅細菌目占有一定比例，分別為23.25%和14.16%，推測該菌種可能較多的分布于蝦殼表面，因此蝦仁在剝殼過程中豐度顯著下降。和蝦仁的物種組成相比，去頭尾蝦和整蝦表現(xiàn)出來的菌種多樣性更高。微凍4周后，假單胞菌目和交替單胞菌目在整蝦、去頭尾蝦和蝦仁中的比例總和分別為95.30%、96.96%和96.92% (圖3-c)，成為貯藏末期的絕對優(yōu)勢腐敗菌，使凡納濱對蝦在貯藏中產(chǎn)生強烈的腐敗氣味從而不能被消費者所接受。

圖3 不同形式對蝦樣品微生物物種組成 (目水平)數(shù)字0、2、4分別表示貯藏0周、2周和4周；后圖同此Figure 3 Bacterial community composition at order level of L. vannamei with different formsThe number 0, 2 and 4 indicate the storage time of 0 week,2 weeks and 4 weeks. The same below.

圖4 不同形式對蝦樣品微生物物種組成 (屬水平)Figure 4 Bacterial community composition at genus level of L. vannamei with different forms

在屬水平上 (圖4)，新鮮蝦仁表面附著微生物主要為弧菌屬 (47.49%)，其他菌種比例相對較高(33.47%)，希瓦氏菌屬占比10.55%。在新鮮去頭尾蝦中，除弧菌屬 (34.68%) 和其他菌種 (35.85%)外，比例最大的是弓形菌屬 (12.12%) 和希瓦氏菌屬 (7.14%)。其他菌種 (34.55%)、弧菌屬 (17.57%)、黃桿菌屬 (14.77%)、弓形菌屬 (10.13%) 和希瓦氏菌屬 (9.45%) 構(gòu)成了新鮮整蝦的主要微生物。弓形菌屬大比例存在于去頭尾蝦和整蝦中，蝦仁中比例較少 (圖4-a)，由此推測該菌屬可能附著在蝦殼表面生長。微凍貯藏2周后，蝦仁中希瓦氏菌屬和假單胞菌屬比例大幅增加，分別為41.42%和46.58%。去頭尾蝦中的菌種也逐漸豐富起來，假紅桿菌屬(20.74%)、不動桿菌屬 (18.26%)、希瓦氏菌屬(11.83%)、嗜冷桿菌屬 (6.35%) 和其他菌種(25.14%) 均為相對豐度較高的菌群。整蝦中的菌相組成類似于去頭尾蝦，嗜冷桿菌屬、弓形菌屬和黃桿菌屬比例更高，分別達29.28%、12.80%和12.81%。而假紅桿菌屬、不動桿菌屬的相對豐度較低，菌種比例分別為6.52%和8.91%。微凍4周后，各組樣品的菌相組成均逐漸變得單一。蝦仁樣品中占據(jù)主要地位的菌屬主要為假單胞菌屬 (55.50%)和希瓦氏菌屬 (41.14%)。去頭尾蝦的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬 (65.87%)、希瓦氏菌屬 (21.90%) 和部分嗜冷桿菌屬 (9.09%)。整蝦中除假單胞菌屬 (52.07%)和嗜冷桿菌屬 (18.01%) 外，假交替單胞菌屬具有一定比例，占總菌群量的25.08%。由菌種變化趨勢 (圖4) 可知，微凍溫度可大幅減少對蝦樣品中的微生物種類，但仍然存在假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等幾種典型的嗜冷菌屬，隨貯藏時間的延長比例有所增加。田鳳和王玲[28]對腐敗的凡納濱對蝦分離優(yōu)勢菌群，同樣得到假單胞菌和希瓦氏菌所占的比例較高的結(jié)論。因此可以推測假單胞菌屬和希瓦氏菌屬是凡納濱對蝦的主要腐敗菌，代謝力強，能適應(yīng)低溫環(huán)境，是造成高蛋白水產(chǎn)品腐敗的主要原因。然而，研究發(fā)現(xiàn)冷藏條件下青蝦 (Macrobrachium nipponense) 的優(yōu)勢菌群主要是不動桿菌、黃桿菌和希瓦氏菌[29]；冷藏克氏原螯蝦 (Procambarus clarkii) 的優(yōu)勢腐敗菌為希瓦氏菌屬、肉食桿菌屬、嗜冷桿菌屬等[14]；冷藏小黃魚 (Larimichthys polyactis) 在腐敗末期的微生物以希瓦氏菌屬、變形桿菌屬和普羅威斯登菌屬等為主[30]?？梢妰?yōu)勢腐敗菌因水產(chǎn)品種類不同而有所差異。

2.4 物種組成熱圖與關(guān)鍵物種差異

熱圖是數(shù)據(jù)的一種二維呈現(xiàn)，將高低豐度物種分塊聚集，通過顏色梯度直觀表現(xiàn)數(shù)據(jù)大小，反映各樣本之間的微生物組成的相似性和差異性[31]。圖5為整蝦、去頭尾蝦和蝦仁在屬水平上的物種豐度熱圖。由橫向聚類分析發(fā)現(xiàn)，去頭尾蝦和整蝦聚為一類，蝦仁單獨一類，說明蝦仁中的微生物種類及組成與其他兩組樣品差異較大。從相對豐度來看，3組樣品中的希瓦氏菌屬和假單胞菌屬較其他菌種相對豐度更高，嗜冷菌屬、假交替單胞菌屬、黃桿菌屬等在整蝦中豐度最高，弧菌屬在蝦仁中比例最大。由此可見，蝦仁的制備過程是弧菌屬污染樣品的主要階段，可能會對蝦產(chǎn)品的質(zhì)量安全造成隱患[10]。通過顏色梯度看，各組樣品的微生物組成中整蝦物種種類最為豐富，其次為去頭尾蝦，最后是蝦仁，這表明在去頭尾去殼過程中部分微生物減少，該結(jié)果與凡納濱對蝦樣品物種組成分析結(jié)果一致。

圖5 不同形式對蝦樣品微生物豐度聚類熱圖 (屬水平)同一行中顏色深淺表示該微生物在不同樣品中的豐度差異；圖上方進化樹表明樣本間的相似程度；圖左方進化樹表明微生物間的相似程度Figure 5 Microbial community heatmap analysis at genus level of L. vannamei with different formsThe shade of color in the same row indicates the difference in the abundance of the microorganism in different samples; the evolutionary tree on the top of the figure indicates the degree of similarity between samples; the evolutionary tree on the left of the figure indicates the degree of similarity between microorganisms.

蝦仁中相對豐度較高的菌種為假單胞菌屬、希瓦氏菌屬和弧菌屬，除此之外，其他菌種豐度均不足1%。去頭尾蝦中菌種比例最大的是假單胞菌屬和希瓦氏菌屬，均超過25%。另外，除假交替單胞菌屬和肉桿菌屬的豐度低于1%，其余菌種均占有一定的比例。而整蝦的主要微生物有嗜冷菌屬、假單胞菌屬和希瓦氏菌屬，其余菌群相對豐度均高于1%，各占一定比例 (表4)。此結(jié)果同樣表明去頭尾蝦和整蝦中的菌群豐富度較蝦仁更高，較好地驗證了上述熱圖和物種組成分析的結(jié)果。

表4 不同形式對蝦樣品關(guān)鍵物種差異 (屬水平)Table 4 Key species differences at genus level of L. vannamei with different forms %

3 結(jié)論

本實驗以高通量測序技術(shù)為核心，全面反映了微凍貯藏環(huán)境下凡納濱對蝦蝦仁、去頭尾蝦和整蝦的微生物組成。結(jié)果表明，整蝦、蝦仁和去頭尾蝦這3種形態(tài)的蝦在微凍環(huán)境下的菌種比例差異明顯。其中，在屬水平上，新鮮蝦仁主要包括弧菌屬、希瓦氏菌屬和其他菌屬，去頭尾蝦中主要為弧菌屬、弓形菌屬等，整蝦中主要為弧菌屬、黃桿菌屬等。經(jīng)過4周的微凍貯藏后，凡納濱對蝦樣品存在嚴重的腐敗、黑變現(xiàn)象以及產(chǎn)生了強烈的不良氣味，而此時假單胞菌屬、希瓦氏菌屬和嗜冷菌屬在各組樣品的微生物組成中占據(jù)主導(dǎo)地位。因此以上菌屬對凡納濱對蝦的品質(zhì)劣變起關(guān)鍵作用，在后續(xù)研究中應(yīng)重點關(guān)注以保障對蝦產(chǎn)品的質(zhì)量。其次，紅細菌目、弓形菌屬等微生物主要存在于蝦殼表面，在整蝦和去頭尾蝦中占有很大比例，同樣應(yīng)對此種特殊分布的菌種加以關(guān)注并進行控制。另外，將新鮮樣品與微凍2周和4周的樣品進行對比，微生物的種類從豐富逐漸變得單一，可見微凍溫度對微生物的生長有一定的抑制作用。

綜上所述，雖然凡納濱對蝦整蝦、去頭尾蝦和蝦仁的優(yōu)勢腐敗菌種類差異不明顯，但其在不同貯藏時期的菌群組成、菌種豐度、菌種對微凍環(huán)境的耐受性等卻有較大的差別。因此，今后在凡納濱對蝦的貯運流通過程中，可采用保鮮劑、抑菌劑、減菌化處理等手段結(jié)合低溫環(huán)境對優(yōu)勢腐敗菌種進行針對性抑制，從而延緩產(chǎn)品的鮮度下降及品質(zhì)劣變現(xiàn)象，延長對蝦貨架期，滿足消費者需求。