臺盼藍(lán)活體染色法觀察瓦氏黃顙魚血脾屏障研究

賀 揚(yáng) ，戴旭平，樊 威，王 均 ，覃川杰 ，陳 杰，曹心雨

（1. 內(nèi)江師范學(xué)院/長江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江 641000； 2. 內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641000； 3. 四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 內(nèi)江 641000）

瓦式黃顙魚 (Pelteobagrus vachelli) 屬鲇形目、鲿科，是黃顙魚屬中體型最大的一個種[1]。相比同屬的黃顙魚 (P. fulvidraco)，瓦氏黃顙魚的生長速度和成活率均較高，加之其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富、無肌間刺，深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者喜愛，已在我國多個地區(qū)廣泛養(yǎng)殖[2]。養(yǎng)殖過程中，疾病是威脅瓦式黃顙魚產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。已報道多種細(xì)菌和寄生蟲可感染瓦氏黃顙魚，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，如嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)[3]、愛德華氏菌 (Edwardsiella ictaluri)[4]、小瓜蟲 (Ichthyophthirius multifiliis)[5]等。研究瓦式黃顙魚免疫系統(tǒng)的組成以及應(yīng)對抗原的免疫反應(yīng)將為疾病的免疫調(diào)節(jié)防治提供基礎(chǔ)資料。

脾臟被認(rèn)為是魚類重要的淋巴細(xì)胞聚集器官，也是一個精致的過濾器，參與了衰老或受損紅細(xì)胞、血源性抗原以及各類血源性異物的過濾和清除[6]。Weiss等[7]發(fā)現(xiàn)小鼠 (Mus musculus) 的脾臟中存在過濾床——血脾屏障，可過濾血液中的瘧原蟲，保護(hù)脾臟的造血組織。血脾屏障也被證實(shí)存在于哺乳動物脾臟的紅髓及邊緣區(qū)，環(huán)繞白髓[8]。然而，魚類的脾臟與哺乳動物的脾臟在組織結(jié)構(gòu)上存在較大差異，魚類的脾臟紅髓和白髓分界不清，無邊緣區(qū)[9]。因此關(guān)于魚類的血脾屏障部位有待進(jìn)一步研究。

本研究以瓦氏黃顙魚脾臟為研究對象，運(yùn)用組織學(xué)方法對其顯微鏡結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。同時，使用臺盼藍(lán)活體染色法動態(tài)監(jiān)測臺盼藍(lán)在瓦氏黃顙魚脾臟中的含量和位置，對血脾屏障在脾臟免疫中的作用進(jìn)行了初探，以期為瓦氏黃顙魚疾病的防治研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚為健康瓦氏黃顙魚，2019年9月購于四川內(nèi)江某魚市場，體質(zhì)量約 (50±10) g。運(yùn)至長江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周，每2 d換水一次，每次換1/3。參照《實(shí)用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)》[10]配置Harris改良蘇木素液、醇溶性伊紅染色液以及石蠟包埋和染色過程中涉及的梯度乙醇等。參照林鴻翔和朱建善[11]配置改良James染色相關(guān)染液。1%臺盼藍(lán)注射液的配置方法為1 g臺盼藍(lán)加入100 mL生理鹽水中，煮沸10 min，普通濾紙過濾備用。所需試劑均購于市售，級別為分析純。

1.2 脾形態(tài)觀察

隨機(jī)選取6尾健康的瓦氏黃顙魚，解剖前使用1 ml·L?1乙二醇苯醚麻醉致死，置于解剖盤中。解剖前將實(shí)驗(yàn)魚左側(cè)平放；剪刀由肛門前端開剪，斜向上剪至側(cè)線下方，然后平行側(cè)線剪至胸鰭基部后端，最后斜向下剪至圍心腔前端，暴露實(shí)驗(yàn)魚腹腔，觀察其脾臟位置、形態(tài)和顏色。去除內(nèi)臟組織后，稱量魚體質(zhì)量 (g)；采集實(shí)驗(yàn)魚脾臟，稱量脾質(zhì)量 (g)，使用公式計算脾體指數(shù)：脾體指數(shù)=脾質(zhì)量/魚體質(zhì)量×100%[12]。

1.3 脾組織結(jié)構(gòu)觀察

瓦式黃顙魚脾臟經(jīng)PBS洗滌去除多余的成分(表面血液和脂肪組織)，用濾紙吸干表面水分，置于塑料包埋框中。立即浸入4%預(yù)冷的多聚甲醛中固定48～72 h，組織經(jīng)梯度乙醇脫水、甲苯透明、浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋。石蠟包埋塊，使用轉(zhuǎn)輪式組織切片機(jī) (Leica) 進(jìn)行粗修，完全暴露組織后，以3 μm連續(xù)切片2張，鋪展于2張載玻片上，分別用于HE染色[10]和改良James染色[11]。

1.4 臺盼藍(lán)活體染色

用1 ml·L?1乙二醇苯醚麻醉30尾健康瓦氏黃顙魚后，腹腔注射1%臺盼藍(lán)注射液 (0.2 mL·尾?1)[13]。注射后立即放入水中繼續(xù)飼養(yǎng)。分別于注射后第0、第4、第8、第24、第48和第72小時隨機(jī)采集5尾魚的脾臟，按1.3中方法進(jìn)行固定、包埋和切片。撈取連續(xù)2張切片，一張用于HE染色，一張不染色直接脫蠟封片。

1.5 統(tǒng)計與分析

組織學(xué)觀察使用Motic SMZ-16 8型數(shù)碼顯微鏡，并用Moticam 2506數(shù)碼成像系統(tǒng)采集圖片。正常組織的HE染色和James染色觀察放大倍數(shù)為200×或400×，低倍觀察脾臟的組成要素、紅髓和白髓的分界等，高倍觀察各組成要素的形態(tài)。血脾屏障部位使用HE染色的臺盼藍(lán)進(jìn)行觀察和定位；血脾屏障的功能使用未染色的切片，對每個切片于400×放大倍數(shù)隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行圖像采集。采集的圖片使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件的count/size，以臺盼藍(lán)顏色為目標(biāo)，記錄臺盼藍(lán)的分布面積，同時記錄整個視野的有效面積，計算臺盼藍(lán)占有效面積的比值，公式為：臺盼藍(lán)面積比=臺盼藍(lán)面積/有效面積×100%，并應(yīng)用軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，軟件Graph Pad Prism 5作圖。

2 結(jié)果

2.1 脾臟的解剖位置與形態(tài)

沿瓦氏黃顙魚左側(cè)剖開，脾臟被肝和胃覆蓋，位于鰾腹面。脾臟為獨(dú)立的器官，呈暗紅色、形狀不規(guī)則且有的分葉，其背側(cè)略微鼓起，與前腸和肝相接；腹側(cè)平坦，貼于鰾壁。稱量魚體質(zhì)量和脾臟質(zhì)量，計算得脾體指數(shù)約0.120%～0.273%(表 1)。

表1 瓦氏黃顙魚脾體指數(shù)Table 1 Splenic somatic index of P. vachelli

2.2 脾臟的組織結(jié)構(gòu)

HE染色觀察瓦氏黃顙魚脾臟的組織結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其脾臟由被膜、不發(fā)達(dá)的脾小梁和脾實(shí)質(zhì)組成。脾實(shí)質(zhì)由紅髓和白髓構(gòu)成，之間無明顯界限。被膜由薄層結(jié)締組織和單層扁平上皮細(xì)胞組成。被膜向脾內(nèi)延伸形成不發(fā)達(dá)的脾小梁，脾小梁細(xì)而少(圖1-a)。紅髓以伊紅色為主，脾索呈不規(guī)則條索狀，與其他脾索相互交織形成似網(wǎng)狀的支架；脾竇為脾索交織形成的網(wǎng)眼，形狀不規(guī)則，脾索含有紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等各類血細(xì)胞。白髓著色較淺，主要由淋巴組織、黑色素巨噬細(xì)胞中心和橢球體構(gòu)成。淋巴細(xì)胞分布散在，部分聚集成群，散在于脾實(shí)質(zhì)中或多位于橢球體周圍 (圖1-b)；黑色素巨噬細(xì)胞中心大小不等，有單層扁平細(xì)胞包裹于外周 (圖1-c)，一般位于血管周圍或者環(huán)繞血管邊緣，呈棕黃色并間雜少量黑色團(tuán)塊；橢球體染色淺，中央有橢球毛細(xì)血管 (又稱微動脈血管)，管腔中偶爾看見單個紅細(xì)胞 (圖1-d)。

圖1 脾臟切片HE染色觀察a. 脾被膜 (→) 和脾小梁 (→)；b. 聚集成團(tuán)的淋巴細(xì)胞 (○) 和散在淋巴細(xì)胞 (→)；c. 黑色素巨噬細(xì)胞中心 (★)由單層扁平細(xì)胞包裹(→)；d. 白髓中橢球體 (→)Figure 1 Pathological of spleen stained by HEa. Splenic capsule (→) and trabeculae (→); b. Clustered (○) and scattered (→) lymphocytes; c. MMCs surrounded (★) by flat cells (→); d. Ellipsoids in white pulps (→)

2.3 脾臟的纖維組成

改良James染色觀察瓦氏黃顙魚脾臟的纖維分布情況發(fā)現(xiàn)，其脾臟被膜由網(wǎng)狀纖維與膠原纖維相互纏繞形成 (圖2-a)；網(wǎng)狀纖維在脾實(shí)質(zhì)中分布廣泛，在紅髓中沿脾竇呈樹根狀分布，分支多 (圖2-b)；在白髓中沿橢球體呈單層或雙層環(huán)狀分布，分支少(圖2-c)；在血管周圍呈放射狀分布 (圖2-d)。膠原纖維多存在于紅髓中，在血管周圍呈層狀聚集 (圖2-e)，在白髓中含量少 (圖2-f)。

圖2 正常脾臟組織切片改良James染色觀察a. 網(wǎng)狀纖維與膠原纖維相互纏繞形成被膜 (→)；b. 紅髓內(nèi)網(wǎng)狀纖維 (→)，白髓內(nèi)網(wǎng)狀纖維 (→)；c. 橢球體周圍網(wǎng)狀纖維 (→)；d. 血管周圍放射狀網(wǎng)狀纖維 (→)；e. 血管周圍膠原纖維 (★)；f. 白髓中膠原纖維Figure 2 Normal spleen stained by Jamesa. Reticular fibers and collagen fibers twine to surround capsule (→); b. Reticular fibers satiated in red pulps (→) and white pulps (→);c. Reticular fibers in ellipsoids (→); d. Reticular fibers satiated in white pulps (→); e. Collagen fibers surrounding the vascular (★); f. Collagen fibers satiated in white pulps

2.4 血脾屏障

使用臺盼藍(lán)腹腔注射瓦式黃顙魚，HE染色觀察臺盼藍(lán)在其脾組織中的分布部位，進(jìn)行血脾屏障位置觀察。結(jié)果顯示，臺盼藍(lán)主要分布于脾臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，包括脾血管內(nèi)皮細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞和橢球體內(nèi)皮細(xì)胞 (圖3-a)。未染色的脾臟，使用IPP 6.0測定臺盼藍(lán)分布面積，計算臺盼藍(lán)面積比(圖3-b)。結(jié)果顯示，第0小時脾組織中無臺盼藍(lán)顆粒存在 (圖3-c)；第4小時臺盼藍(lán)開始在脾臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)，平均面積比為0.13% (圖3-d)；第8小時臺盼藍(lán)數(shù)量增多 (圖3-e)，平均面積比為0.25%，但與第4小時無顯著差異 (P＞0.05)；第24小時臺盼藍(lán)面積顯著增大至整個視野的1.27%，呈團(tuán)塊狀 (圖 3-f，0.01＜P＜0.05)；第 48 小時進(jìn)一步明顯增大至整個視野的3.70% (圖3-g)；至第72小時臺盼藍(lán)在橢球體內(nèi)皮細(xì)胞中達(dá)到峰值(圖3-h)，平均面積比為5.58%，極顯著高于其他時間點(diǎn)(P＜0.01)。

圖3 瓦氏黃顙魚脾臟中不同時間點(diǎn)臺盼藍(lán)面積比的變化趨勢a. 臺盼藍(lán)分布于內(nèi)皮細(xì)胞中(→)，HE；b. 臺盼藍(lán)定量分析；*. 0.01＜P＜0.05; **. P＜0.01；c. 注射前脾臟組織切片，未染色；d. 注射第4小時，脾臟組織切片，未染色；e. 注射第8小時，脾臟組織切片，未染色；f. 注射第24小時，脾臟組織切片，未染色；g. 注射第48小時，脾臟組織切片，未染色；h. 注射第72小時，脾臟組織切片，未染色Figure 3 Dynamic changes of area rate of Trypan blue in spleen of P. vachellia. Trpan blue satiated in endotheliocytes (→), HE staining; b. Quantity analysis of Trypan blue; c. Pathology of spleen before injection, unstained;d. Pathology of spleen at 4th hour post injection, unstained; e. Pathology of spleen at 8th hour post injection, unstained; f. Pathology of spleen at 24th hour post injection, unstained; g. Pathology of spleen at 48th hour post injection, unstained; h. Pathology of spleen at 72nd hour post injection, unstained

3 討論

3.1 瓦氏黃顙魚脾臟的形態(tài)

低等魚類盲鰻 (Myxine glutinosa) 沒有脾臟，軟骨魚類和硬骨魚類具有獨(dú)立的脾臟[14]。受腹腔空間的限制、肝臟的擠壓以及魚體形狀的影響，硬骨魚的脾臟在形態(tài)學(xué)上存在很大差異。如興國紅鯉( Xingguo Cyprinus flammans) 的脾臟呈長條形，前寬后窄[15]；駝背鱸 (Cromileptes altivelis) 的脾臟呈扁平長條狀，其腹面平，背面略凸[16]；草魚 (Ctenopharyngodon idellus) 的脾臟為扁平橢圓形，呈長條狀[17]；南方鲇 (Silurus meridionalis) 脾的外表形狀大多呈蝴蝶狀、中部愈合、前后部分葉，也有的呈桃狀、分左右兩葉、一般右葉大于左葉[18]。本實(shí)驗(yàn)中瓦氏黃顙魚脾臟為獨(dú)立的臟器，形狀不規(guī)則，且有的分葉，有的不分葉。軟骨魚銀鮫的脾臟指數(shù)大于1%，人類的脾臟指數(shù)約0.27%，而硬骨魚類的脾體指數(shù)差異較大[19]。尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus) 的脾體指數(shù)為0.03%～0.14%[13]。本實(shí)驗(yàn)中健康瓦氏黃顙魚的脾臟質(zhì)量為0.025～0.034 g，脾體指數(shù)為0.120%～0.273%。作為魚類重要的免疫器官，脾臟腫大，脾體指數(shù)升高，常預(yù)示著魚體感染。Haididi等[20]研究發(fā)現(xiàn)虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)對嗜冷黃桿菌 (Flavobacterium psychrophilum) 的抵抗強(qiáng)弱與脾體指數(shù)大小呈正相關(guān)；Harun等[21]研究發(fā)現(xiàn)虹鱒感染魯氏耶爾森氏菌 (Yersinia ruckeri)后，脾體指數(shù)明顯增大。Wiens等[22]通過脾臟切除方法研究虹鱒對嗜冷黃桿菌的抵抗力發(fā)現(xiàn)，脾大并不意味著對嗜冷黃桿菌抵抗力強(qiáng)，但可間接反映免疫狀態(tài)?？梢?，脾臟的大小與免疫具有一定聯(lián)系，明確兩者之間的相關(guān)性可有利于品種選育和感染的判定。

3.2 脾臟的組織結(jié)構(gòu)

和哺乳動物的紅髓、白髓分界明顯不同，硬骨魚的脾臟紅髓和白髓無明顯界限，無脾小結(jié)，也無淋巴鞘結(jié)構(gòu)。但部分魚類淋巴細(xì)胞可聚集成團(tuán)，出現(xiàn)淋巴細(xì)胞小泡，如鰻鱺 (Anguilla japonica)[23]、羅非魚[13]。本研究中淋巴細(xì)胞多散在分布于白髓中，少見聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。被膜-小梁、網(wǎng)狀纖維和膠原纖維共同組成了脾臟的支架。依靠發(fā)達(dá)的脾臟支架，哺乳動物的脾臟具有較強(qiáng)的儲血和釋血能力，但硬骨魚類的脾臟支架差異較大。如巖原鯉(Procypris rabaudi) 的脾臟被膜薄，脾小梁發(fā)達(dá)，伸入脾實(shí)質(zhì)中，將其分隔成一個個明顯的小葉[24]。鯉 (C. carpio) 和鯽 (Carassius auratus) 脾臟中沒有小梁[25]。本實(shí)驗(yàn)中瓦氏黃顙魚脾臟的被膜為薄層被膜，小梁不發(fā)達(dá)，不同于黃顙魚的脾臟小梁明顯、可深入脾臟實(shí)質(zhì)將其分割成許多小葉[26]。這可能是由于種屬差異，也可能與養(yǎng)殖環(huán)境條件中的各因素有關(guān)。魚類脾臟的組織結(jié)構(gòu)研究不僅可以豐富魚類免疫學(xué)研究的基礎(chǔ)資料，也可用于魚類免疫指標(biāo)的評價。

3.3 血脾屏障

血脾屏障是脾臟的重要先天性免疫部位，具有機(jī)械屏障、生物屏障、傳遞抗原信息、維持白髓內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)控特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)等功能[27]。血脾屏障的位置通?？刹捎米⑸錈晒馕镔|(zhì)、臺盼藍(lán)和碳粒等進(jìn)行標(biāo)記，利用組織學(xué)方法分析注射物質(zhì)在脾臟中的分布情況。通過上述方法標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，血脾屏障在大鼠位于脾臟的邊緣區(qū)[28]，在鴨[29]、雞[30]、中華鱉[31]、羅非魚[13]等位于脾臟的橢球體周圍。血脾屏障同血腦屏障一樣，均具有阻止病原入侵、過濾大分子物質(zhì)和吞噬功能。但血脾屏障相對松散，可過濾抗原物質(zhì)，但允許其他物質(zhì)正常通過。研究昆明種小鼠的血脾屏障發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞和邊緣竇內(nèi)皮細(xì)胞均參與了碳粒的吞噬和清除[32]。使用臺盼藍(lán)腹腔注射羅非魚觀察血脾屏障組成顯示，橢球體內(nèi)皮細(xì)胞是血脾屏障的重要組成細(xì)胞，可攝取和清除臺盼藍(lán)[13]。與之相似，本實(shí)驗(yàn)中使用臺盼藍(lán)腹腔注射瓦氏黃顙魚后，臺盼藍(lán)也主要分布在橢球體內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，表明橢球體內(nèi)皮細(xì)胞是瓦氏黃顙魚血脾屏障的重要組成成分。血脾屏障對于不同抗原的吞噬作用出現(xiàn)時間略有差異：在小鼠尾靜脈注射碳粒第3小時即可出現(xiàn)吞噬現(xiàn)象，但對于新型隱球蟲(Cryptococcus neoformans) 需3 d才出現(xiàn)吞噬作用[32]。同樣對尼羅羅非魚腹腔注射臺盼藍(lán)第4小時即觀察到臺盼藍(lán)，但對于無乳鏈球菌 (Group B Streptococcus) 則需要24 h或更長時間[13]。本研究中，瓦氏黃顙魚腹腔注射臺盼藍(lán)后，也能在第4小時觀察到少量內(nèi)皮細(xì)胞吞噬臺盼藍(lán)現(xiàn)象，但對于細(xì)菌性抗原的屏障作用還有待進(jìn)一步研究。不同物種間血脾屏障的抗原清除作用也存在差異。尼羅羅非魚腹腔注射臺盼藍(lán)后，第24小時即出現(xiàn)了明顯的臺盼藍(lán)減少，但本研究的瓦氏黃顙魚至第72小時臺盼藍(lán)的數(shù)量仍未減少。此外，除內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞外，有研究表明網(wǎng)狀纖維也是構(gòu)成屏障的組成成分，但本研究尚未觀察到該現(xiàn)象，可能是腹腔注射的緣故。在尼羅羅非魚血脾屏障研究中，使用腹腔注射未發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀纖維是血脾屏障的組成成分，但使用尾靜脈注射即可觀察到網(wǎng)狀纖維的作用[13]。因此，后續(xù)研究有必要對瓦氏黃顙魚進(jìn)行尾靜脈注射，觀察網(wǎng)狀纖維是否具有屏障作用。