?；撬釋β研析K鲹腸道微生物及免疫功能的影響

馬啟偉 ，郭 梁, ，劉 波, ，劉寶鎖, ，朱克誠, ，郭華陽, ，張 楠, ，楊靜文, ，張殿昌,

（1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300； 3. 廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510300）

?；撬?(Taurine) 是一種β含硫氨基酸，化學(xué)名為2-氨基乙磺酸 (C2H7NO3S)，以游離或者小肽的形式存在于組織中；?；撬嵩隰~體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能，在生長性能、神經(jīng)調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、抗氧化狀態(tài)、抗應(yīng)激能力、解毒作用、配子質(zhì)量、消化酶活性和腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用[1-2]。有研究表明，植物性蛋白對魚類的生長、免疫、腸道微生物菌群有顯著性影響，植物性蛋白替代魚粉不僅會導(dǎo)致魚類免疫能力下降，還會造成腸道微生物菌群的改變；引起金鯛(Sparus aurata)[3]、大西洋鮭 (Salmo salar)[4]、大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[5]、絲尾鳠 (Hemibagrus wyckioides)[6]、條石鯛 (Oplegnathus fasciatus)[7]、虹鱒 (Oncorhychus mykiss)[8]、日本鰻鱺 (Anguill japonica)[9]腸道菌群改變、形態(tài)異常并引發(fā)炎癥反應(yīng)。然而牛磺酸能夠增加植物性蛋白代替魚粉的使用量，緩解不良反應(yīng)[10]；一些研究證實(shí)飼糧中添加?；撬釋Σ煌笮『头N類的魚類腸道微生物菌群和腸道免疫產(chǎn)生有益影響；例如，飼糧中添加?；撬峥捎行Ь徑馍帻X鱸 (Dicentrarchus labrax)[11]豆粕替代魚粉產(chǎn)生的腸道異常并提高草魚 (Ctenopharyngodon idella)[12]的腸道免疫功能。

魚類腸道中的微生物菌群被稱為宿主的第二基因組，是腸道黏膜屏障的重要組成部分，與機(jī)體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，腸道菌群的穩(wěn)定保證了腸道健康，如果腸道菌群紊亂則極易引起宿主腸道疾病[13]。?；撬岬亩喾N生理功能已使其成為研究熱點(diǎn)，然而，關(guān)于?；撬釋λ鷦?dòng)物腸道影響的資料有限，且多集中于消化酶代謝、腸道形態(tài)和屏障功能等方面，對腸道免疫的研究較少。Toll樣受體 (TLRs)/NF-κB信號通路在先天免疫中發(fā)揮重要作用，TLRs將病原相關(guān)分子刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活化，能介導(dǎo)IL-1β以及TNF-α等炎癥介質(zhì)發(fā)揮其促炎作用[14]。?；撬岷投喾N細(xì)胞因子之間存在潛在關(guān)系，?；撬崮軌蛞种芓LRs/NF-κB信號通路、改善炎癥損傷，能夠調(diào)節(jié)免疫基因在魚腸道中表達(dá)[15]；另外，當(dāng)機(jī)體處于炎癥時(shí)，?；撬岙a(chǎn)生的氯胺也具有抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用[16]。

卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 為暖水性、中上層洄游魚類，由于其生長迅速、肉質(zhì)鮮美，已成為南海沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖魚類[17]。研究表明以植物性蛋白替代魚粉時(shí)，會對卵形鯧鲹生長、抗氧化和免疫，以及腸道微生物菌群產(chǎn)生顯著性影響[18-20]。另外，本試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)?；撬崮軌蛱岣呗研析K鲹生長性能和抗氧化能力[21]；基于?；撬釋χ参镄缘鞍滋娲~粉產(chǎn)生的不利影響具有緩解作用，本試驗(yàn)旨在探討?；撬釋β研析K鲹腸道微生物菌群和免疫方面的影響，為明確植物蛋白替代飼料中添加牛磺酸是否影響魚體內(nèi)腸道菌群多樣性及免疫功能提供有力證據(jù)，以期為卵形鯧鲹健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)以魚粉、發(fā)酵豆粕和玉米蛋白粉作為蛋白源，魚油作為脂肪源，共配制了5種不同?；撬崽砑恿康牡鹊戎暳?，所有飼料原料粉碎后過40目篩網(wǎng)，加入魚油和水混勻，經(jīng)過制粒機(jī) (G-500，華南理工大學(xué)) 制成2.5 mm的沉性飼料顆粒，于4 ℃密封保存?；A(chǔ)試驗(yàn)日糧粗蛋白和粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為427和100 g·kg?1；灰分和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為83和101 g·kg?1；各組牛磺酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 1.3 g·kg?1(T0)、4.4 g·kg?1(T1)、7.4 g·kg?1(T2)、10.5 g·kg?1(T3)、12.7 g·kg?1(T4)[21]。

飼養(yǎng)試驗(yàn)在海南省新村港進(jìn)行，所有試驗(yàn)用魚均采于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，將750尾大小均一、體質(zhì)健康的卵形鯧鲹 (81.0±0.5) g隨機(jī)分配到15個(gè)網(wǎng)箱 (1 m×1 m×1.5 m) 中，隨機(jī)分成5組 (每組150尾，分為3個(gè)平行)。試驗(yàn)開始前使用T0組飼料喂養(yǎng)1周，使試驗(yàn)魚適應(yīng)人工飼料與飼養(yǎng)環(huán)境。試驗(yàn)開始時(shí)試驗(yàn)魚已饑餓24 h，然后每組魚用相對應(yīng)的飼料每天飽食投喂2次 (8:00和16:00)，持續(xù)8周。試驗(yàn)期間溫度28～32 ℃，pH 7.4～8.3，鹽度 34～36，溶解氧質(zhì)量濃度＞6.0 mg·L?1。

1.2 樣品采集

喂養(yǎng)階段結(jié)束后，將魚饑餓24 h，從每個(gè)網(wǎng)箱中隨機(jī)取9尾，用丁香酚 (上海醫(yī)療器械股份有限公司) 麻醉，使用2.5 mL不含肝素的注射器從尾靜脈采血，離心后 (3 000×g, 4 ℃, 10 min) 取血清于?20 ℃保存；冰上解剖取其腸道，剔除腸道周邊脂肪，每一樣品單獨(dú)放于對應(yīng)的2 mL凍存管中，液氮速凍，?80 ℃保存，用于腸道微生物分析(n=9) 和免疫基因的表達(dá) (n=9)。

1.3 血清免疫指標(biāo)測定

根據(jù)酶活試劑盒 (北京華英生物技術(shù)研究所)說明書，測定補(bǔ)體C3/C4和免疫球蛋白 (IgA、IgG、IgM) 的含量和溶菌酶 (LZM) 活性。

1.4 腸道微生物多樣性測定

1.4.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增 按照天根DNA試劑盒 [ 天根 (北京) 生化科技有限公司 ] 說明書提取卵形鯧鲹腸道細(xì)菌DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，Nanodrop 2000檢測純度和濃度。無菌水稀釋DNA樣本至1 ng·μL?1，使用特異性引物對細(xì)菌16S rDNAV3–V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系 (30 μL) 為 15 μL 的 Phusion Master Mix (新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)、3 μL的正反引物、10 μL (5～10 ng) 的模板 DNA、2 μL 的 ddH2O。PCR反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；對目的條帶使用膠回收試劑盒(Qiagen，德國) 回收產(chǎn)物。引物序列見表1。

表1 細(xì)菌16S rDNA V3—V4可變區(qū)引物Table 1 Bacterial 16S rDNA V3–V4 corresponding primers

1.4.2 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序 使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量保證文庫合格后，基于Ion S5 XL測序平臺，利用單端測序的方法，完成16S V3–V4區(qū)域測序。

1.4.3 測序數(shù)據(jù)處理 從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后，使用FLASH(V 1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/) 對每個(gè)樣本的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始數(shù)據(jù)。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾去除干擾序列，得到有效的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

利用Uparse軟件 (Uparse V7.0.1001, http://www.drive5.com/uparse/)對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析；依據(jù)其算法原則，篩選出OTUs的代表序列 (OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列)，用Mothur方法與SILVA132 (http://www.arbsilva.de/) 對每個(gè)OTU的代表序列做物種注釋，使用MUSCLE (V3.8.31, http://www.drive5.com/muscle/)軟件進(jìn)行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時(shí)對OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性 (ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)、辛普森指數(shù)) 計(jì)算、Beta多樣性 (主坐標(biāo)分析和NMDS分析) 分析，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息。利用R軟件 (V 2.15.3) 繪制稀釋曲線。

1.5 腸道免疫基因表達(dá)分析

卵形鯧鲹腸道總RNA使用總RNA提取試劑盒 (廣州美基生物科技有限公司) 提取，NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) 和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和質(zhì)量；使用PrimeScript? with gDNA Erase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)ToTLR1、ToTLR2、ToNF-kB P65、ToTNF-α、ToIL-1β和ToIL-10 的特異性引物，以卵形鯧鲹EF-1α作為內(nèi)參[22]，引物序列見表2。使用Roche LightCycler 480 II進(jìn)行基因表達(dá)測定，qPCR反應(yīng)體系為12.5 μL，1 μL cDNA 模板 (60 ng·μL?1)，1 μL 正反引物，4.25 μL ddH2O和6.25 μL SYBR Pre-mix ExTaq；反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用2?△△CT進(jìn)行計(jì)算[23]。

表2 卵形鯧鲹腸道免疫基因引物序列Table 2 Real-time quantitative PCR primers for immune related genes in T.ovatus

1.6 數(shù)據(jù)分析

以上數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 (IBM) 軟件進(jìn)行處理和單因素方差 (One-way ANOVA) 分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (X±SE) ”表示，若差異達(dá)到顯著水平 (P＜0.05)，則采用Tukey's進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 腸道微生物分析

2.1.1 序列分析 通過對Reads拼接，平均每樣品測得87 707條tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到82 257條有效數(shù)據(jù)，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到5 382個(gè)OTUs。通過與數(shù)據(jù)庫Silva132比對，進(jìn)行物種注釋，并對不同分類層級統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：能夠注釋到數(shù)據(jù)庫的OTUs數(shù)目為5 130 (95.32%)，門水平的比例為89.61%。試驗(yàn)組的稀釋曲線和Rank Abundance曲線見圖1，各組稀釋曲線逐漸趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，測序覆蓋范圍已基本達(dá)到樣品中所有的物種。

圖1 卵形鯧鲹腸道微生物稀釋曲線 (a) 和Rank abundance曲線 (b) (n=9)Figure 1 Rarefaction (a) and Rank abundance (b) curve of intestinal microbial diversity of T. ovatus

2.1.2 Alpha多樣性分析 卵形鯧鲹腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)見圖2，Alpha多樣性可以反映樣本內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性變化，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)反映菌群豐富度，香農(nóng)-威納指數(shù) (Shannon) 和辛普森指數(shù) (Simpson) 反映菌群多樣性，且兩者間呈現(xiàn)正相關(guān)，數(shù)值越大，表示菌群的豐富度和多樣性越高。Alpha多樣性結(jié)果顯示，隨牛磺酸含量的增加，T1、T2和T3組的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著低于T0組 (對照組，P＜0.05)；T2組的香農(nóng)-威納指數(shù)和辛普森指數(shù)最低，香農(nóng)-威納指數(shù)顯著低于T0和T4組，辛普森指數(shù)顯著低于T0、T3和T4組 (P＜0.05)。

圖2 ?；撬釋β研析K鲹腸道微生物Alpha多樣性分析 (n=9)*. 差異顯著 (P＜0.05)；**. 差異極顯著 (P＜0.01)Figure 2 Alpha diversity analysis of intestinal microbial diversity of T. ovatus*. Significant difference (P＜0.05); **. Very significant difference (P＜0.01)

2.1.3 Beta多樣性分析 Beta多樣性分析 (圖3)可以評估腸道中物種復(fù)雜性方面的差異程度，距離越接近的樣本，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，結(jié)構(gòu)相似度高的樣本傾向于聚集在一起；主成分 (PCoA)和無度量多維標(biāo)定法 (NMDS) 分析顯示，T1、T2和T3組傾向于聚集在一起，物種相似度較高；T1和T4組間樣品距離較遠(yuǎn)，傾向于離散分布，物種組成結(jié)構(gòu)相似度較低。

圖3 卵形鯧鲹腸道微生物Beta多樣性分析分析 (n=9)Figure 3 Beta diversity analysis of intestinal microbiota of T. ovatus

2.1.4 腸道菌群組成及其相對豐度分析 卵形鯧鲹在門水平腸道菌群組成及其相對豐度見圖4，所有試驗(yàn)組腸道微生物菌群在門水平上主要注釋到10個(gè)門和其他的未知微生物群體，占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括變形菌門、軟壁菌門、螺旋體門。T0—T4組變形菌門相對豐度分別為19.6%、11.6%、10.8%、28.1%、41.1%。T0—T4組軟壁菌門相對豐度分別為45.1%、60.4%、56.9%、33.2%、37.0%；T0—T4組螺旋體門相對豐度分別為23.0%、6.4%、12.8%、23.8%、4.1%。T0—T4組擬桿菌門相對豐度分別為1.5%、12.4%、8.7%、5.1%、4.2%。腸道菌群組成及相對豐度分析顯示，隨飼料外源?；撬岷康脑黾樱囼?yàn)組變形菌門、軟壁菌門、螺旋體門和擬桿菌門的相對豐度出現(xiàn)顯著性變化，TI和T2組變形菌門相對豐度較T0組分別減少了8.0%和8.8% (P＜0.05)；T1和T2組軟壁菌門相對豐度較T0組分別增加了15.3%和11.8% (P＜0.05)；T1、T2和T4組螺旋體門相對豐度較T0組分別減少了16.6%、10.2%和18.9% (P＜0.05)；T1和T2組擬桿菌門相對豐度較T0組分別增加了10.9%和7.2% (P＜0.05)。卵形鯧鲹在屬水平腸道菌群組成及其相對豐度見圖5，占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括支原體菌屬、短螺旋體屬和甲基桿菌屬。T3和T4組支原體菌屬相對豐度較T0組分別減少了17.4%和5.6% (P＜0.05)；T2和T3組短螺旋體屬相對豐度較對照組分別增加了13.7%和12.2% (P＜0.05)；T2、T3和T4組甲基桿菌屬相對豐度較T0組分別增加了3.3%、1.7%和1.4%。

圖4 基于門水平上的卵形鯧鲹腸道菌群物種相對豐度柱形圖 (n=9)Figure 4 Bacterial relative abundance in intestine of T. ovatus at phylum level

圖5 基于屬水平上的卵形鯧鲹腸道菌群物種相對豐度柱形圖 (n=9)Figure 5 Bacterial relative abundance in intestine ofT. ovatus at genus level

2.2 血清免疫指標(biāo)

牛磺酸對卵形鯧鲹血清免疫影響指標(biāo)數(shù)據(jù)見表3。隨外源性?；撬岬臄z入，T2、T3和T4組的溶菌酶活性顯著提高 (P＜0.05)；T3組補(bǔ)體C4和免疫球蛋白 (A, G) 含量顯著高于T0組 (P＜0.05)；各組間的補(bǔ)體C3和免疫球蛋白M含量無顯著性差異 (P＞0.05)。

表3 ?；撬釋β研析K鲹血清免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effect of taurine on serum immune parameters of T. ovatus

2.3 腸道免疫基因表達(dá)

?；撬釋β研析K鲹腸道免疫影響數(shù)據(jù)見圖6。結(jié)果顯示，?；撬釋β研析K鲹腸道免疫基因的表達(dá)有顯著性影響；隨飼料牛磺酸含量的增加，ToTLR-1和ToTLR-2基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，試驗(yàn)組基因表達(dá)量顯著低于對照組 (T0,P＜0.05)；T1、T2和T4組的ToNFkB P65表達(dá)量顯著低于T0組 (P＜0.05)；T2、T3和 T4組的ToTNF-α和ToIL-1β的表達(dá)量顯著低于T0組 (P＜0.05)；T3和T4組ToIL-10的表達(dá)量顯著高于對照組 (P＜0.05)，T0、T1和T2組ToIL-10的表達(dá)量無顯著性差異(P＞0.05)。

圖6 免疫相關(guān)基因在卵形鯧鲹腸道中mRNA相對表達(dá)量Figure 6 Relative expression levels of immune-related genes in intestine of T. ovatus

3 討論

腸道微生物與宿主的健康息息相關(guān)，在營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化、吸收和免疫應(yīng)答中起著重要作用；腸道微生物菌群提供了一個(gè)可操縱的腸道環(huán)境，為改善魚體健康，預(yù)防和治療疾病提供重要平臺。魚類腸道微生物菌群多樣性和結(jié)構(gòu)特征會受到多種因素的影響，包括遺傳背景、棲息環(huán)境，飼料成分 (添加劑)、成長階段、藥物 (抗生素) 等[25]。牛磺酸是十二指腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞中最豐富的游離氨基酸，有著多種生物學(xué)功能，廣泛用于食品添加劑行業(yè)[26]。有研究顯示，?；撬崮軐?dǎo)致肉雞小腸長度、上皮細(xì)胞增殖和小腸結(jié)構(gòu)相關(guān)的性能變化[27]；能夠調(diào)節(jié)大

鼠腸道微生態(tài)，抑制有害細(xì)菌的生長；能夠改變豬腸道黏膜的形態(tài)并促進(jìn)腸黏膜損傷的修復(fù)[28]；在水生動(dòng)物中，?；撬嵋呀?jīng)確定在多種魚類體內(nèi)扮演重要角色，對腸道微生物及腸道免疫應(yīng)答具有顯著性影響。本試驗(yàn)中，腸道菌群Alpha多樣性和Beta多樣性分析結(jié)果顯示，飼料中?；撬岷磕軌蛘{(diào)節(jié)腸道微生物菌群的豐富度和多樣性，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)；在卵形鯧鲹腸道菌群組成中占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括變形菌門、軟壁菌門、螺旋體門，這與已有研究一致[29]。在不同種類生物中，腸道菌群組成和豐度往往存在很大差異，這與環(huán)境因子和飼養(yǎng)條件有很大關(guān)系，另外，正常與炎癥個(gè)體腸道菌群同樣存在顯著差異，在患有腸皺紋萎縮和固有層炎癥的大西洋鮭腸道中，乳球菌屬較正常個(gè)體顯著增加[30]。在門水平上，卵形鯧鲹變形菌門和軟壁菌門相對豐度隨?；撬岷匡@著變化，適當(dāng)?shù)呐；撬崽砑幽芙档妥冃尉T和螺旋體門的相對豐度，提高軟壁菌門和擬桿菌門的相對豐度；Yu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，?；撬崮芴岣叽笫髷M桿菌門和降低變形菌門豐度，這與本研究結(jié)果相似。?；撬嵩谌笪镔|(zhì)代謝中起著重要作用，而擬桿菌門是多糖、膽固醇代謝和碳水化合物發(fā)酵的重要參與菌群[31]，改變擬桿菌門豐度有可能是?；撬嵴{(diào)節(jié)三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的另一原因；然而高濃度的?；撬岷繒种破渖L，原因可能是過量的牛磺酸導(dǎo)致腸道處于高酸度環(huán)境，其不適于在這種酸性條件下生長[32]。在屬水平上，卵形鯧鲹支原體菌屬、短螺旋體屬和甲基桿菌屬隨牛磺酸含量發(fā)生顯著變化，支原體菌屬豐度顯著降低，短螺旋體屬豐度顯著增加，甲基桿菌屬也呈增加趨勢；優(yōu)勢菌群往往會影響宿主自身微生物的組成和結(jié)構(gòu)；腸道微生物結(jié)構(gòu)的改變有可能會導(dǎo)致腸道疾病的產(chǎn)生，其在魚類腸道中發(fā)揮的作用還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。短鏈脂肪酸 (SCFAs) 具有多種生理學(xué)功能，能夠提供能量，促進(jìn)鈉的吸收，改善腸道循環(huán)，抑制致病微生物的生長；研究表明牛磺酸能夠提高腸道SCFAs含量，然而變形菌門中包含大多數(shù)的致病菌，?；撬嵊锌赡芡ㄟ^提高腸道SCFAs含量抑制致病微生物，降低致病菌豐度[2]。

牛磺酸是免疫反應(yīng)的有效調(diào)節(jié)劑，能夠通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖和抑制促炎介質(zhì)的產(chǎn)生調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。溶菌酶是一種堿性蛋白質(zhì)，具有溶菌、殺菌、抗病毒的作用，是評價(jià)魚類的非特異性防御能力的重要指標(biāo)；血清補(bǔ)體系統(tǒng)是先天免疫的主要組成部分，補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4在補(bǔ)體的激活過程中發(fā)揮重要作用，能激活補(bǔ)體抵抗病原微生物侵入；免疫球蛋白是免疫活性分子中一種重要抗體，能特異性地結(jié)合抗原[33]。本試驗(yàn)中卵形鯧鲹血清溶菌酶的活性顯著提高，補(bǔ)體C4和免疫球蛋白含量顯著增加，說明適量?；撬崮芴岣呗研析K鲹免疫能力。飼料中添加?；撬嵬瑯幽軌蝻@著增加黃鰭鯛(Acanthopagrus latus)[34]、黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco)[35]、虹鱒[36]、草魚[12]的免疫能力。

動(dòng)物腸道損傷導(dǎo)致腸道炎癥或先天免疫過程的發(fā)生，Toll樣受體 (TLRs) 是病毒、細(xì)菌、真菌的宿主傳感器，Toll樣受體 (TLRs)/NF-κB信號通路在多種脊椎動(dòng)物先天免疫中發(fā)揮重要作用，注射了Poly (I∶C) 和LPS的點(diǎn)帶石斑魚 (Epinephelus coioides) 的TLR-1和TLR-2表達(dá)均顯著上調(diào)[37]。本試驗(yàn)中飼料?；撬岷吭黾语@著下調(diào)腸免疫基因 ToTLR-1、ToTLR-2、ToNFκB P65、ToTNF-α 和ToIL-1β的表達(dá)；顯著上調(diào)腸免疫基因ToIL-10的表達(dá)。?；撬峋哂型ㄟ^抑制NF-κB的活化從而調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子在體內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥過程的能力，研究表明，牛磺酸可以調(diào)節(jié)感染鏈球菌炎癥反應(yīng)期間TLRs/NF-κb信號通路，降低TLR-2和NF-κb P65的表達(dá)[15]。IL-1β和TNF-α的表達(dá)與TLRs有關(guān)，TLR可以激活MyD88依賴性途徑，通過NF-kB誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α表達(dá)[38]。豆粕替代魚粉提高了鱸魚IL-1β和TNF-α的表達(dá)，而通過添加?；撬崮軌蝻@著抑制兩促炎性因子表達(dá)，緩解了植物性蛋白引起的炎癥反應(yīng)；?；撬崮軌蚪档痛笫笱錞NF-α活性和肉雞血漿TNF-α含量，這表明?；撬峥梢酝ㄟ^基因表達(dá)和酶活性兩個(gè)層次對炎性因子產(chǎn)生影響[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10可以下調(diào)TNF-α表達(dá)，補(bǔ)充?；撬嵋部梢越档筒蒴~TNF-α基因的表達(dá)，這可能與IL-10有關(guān)[12]。IL-10是腸道中重要的抗炎細(xì)胞因子，IL-10上調(diào)有利于緩解由植物性蛋白替代引起的腸道炎癥，在本試驗(yàn)中，有可能是?；撬嵋餓L-10基因表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致TNF-α表達(dá)受到抑制。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，與某些生物分子結(jié)合形成的化合物可引起毒性反應(yīng)，有證據(jù)表明?；撬崮軌驕p少炎癥細(xì)胞的浸潤和內(nèi)毒素的含量，緩解小鼠炎癥引起的腸道黏膜損傷，這有可能是?；撬嵬ㄟ^抑制內(nèi)毒素轉(zhuǎn)移來發(fā)揮作用；?；撬徇€能和多種物質(zhì)結(jié)合形成在炎性反應(yīng)中具有重要作用的?；撬岽x物 (TauCl等)，能夠抑制NF-κB的活化和NO、TNF-α、促炎白細(xì)胞介素等的生成，?；撬釘z入有可能導(dǎo)致?；撬岽x物的增加，下調(diào)了促炎因子的表達(dá)[39]。

綜上所述，牛磺酸在卵形鯧鲹腸道中發(fā)揮著重要的生理功能，對腸道菌群及免疫功能有著顯著的影響。?；撬崮芤鹉c道菌群相對豐度和結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致優(yōu)勢菌相對豐度的變化。牛磺酸能夠提高血清溶菌酶活性并增加免疫球蛋白數(shù)量，能夠調(diào)節(jié)腸道TLRs/NF-κB信號通路，下調(diào)促炎因子ToNFkB P65、ToTNF-α、ToIL-1β 和上調(diào)抗炎因子ToIL-10的表達(dá)，提高腸道免疫能力。