代謝組學(xué)在慢性腎臟病中的研究進展*

楊雪，王媛，朱羿霖，史俊，俞曼殊，盛梅笑

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患病率在全球范圍內(nèi)逐年上升，預(yù)計占世界人口的9.1%，與終末期腎病及心血管事件發(fā)生率、死亡率相關(guān)，已成為全球性公共衛(wèi)生問題[1-3]。目前診斷及分期根據(jù)血清肌酐、胱抑素C、腎小球濾過率以及蛋白尿水平等進行評估[4-6]，這些指標(biāo)往往出現(xiàn)在腎臟損害發(fā)生之后，檢測結(jié)果易受多種因素影響。因此，明確CKD發(fā)病機制，篩選敏感且特異的生物標(biāo)志物在臨床的診斷和治療中具有重要意義。組學(xué)是對生物系統(tǒng)在生理、病理狀態(tài)下的相關(guān)信息進行系統(tǒng)全面收集、解析的方法，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等。其中，代謝組學(xué)主要研究生物整體、器官或組織的內(nèi)源性代謝物質(zhì)的代謝途徑及其所受內(nèi)在或者外在因素的影響，并隨時間變化的規(guī)律，將代謝物與生物過程關(guān)聯(lián)起來，最終揭示機體內(nèi)相關(guān)因素的變化[7]。基于代謝組學(xué)方法對腎臟疾病的研究日益增多，腸道菌群、氨基酸、脂肪酸、嘌呤等代謝通路逐漸受到關(guān)注，由此發(fā)現(xiàn)的代謝物(組)，如中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)[8]、腎損傷分子-1(kidneyinjury molecule-1，KIM-1)[9]等已逐漸應(yīng)用于臨床，可作為腎臟疾病診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物。本文對代謝組學(xué)在CKD發(fā)病機制、診斷、預(yù)后、中醫(yī)證型及治療方面的研究進行綜述，旨在為CKD診斷及治療提供新的研究方向及依據(jù)。

1 代謝組學(xué)的概念及意義

代謝組學(xué)，由英國Nicholson教授等在1999年首次提出，是研究生物體在基因修飾下或受病理生理刺激后所有動態(tài)代謝產(chǎn)物的一門學(xué)科[10]，研究對象是相對分子質(zhì)量為1 000 Da以下的內(nèi)源性小分子代謝物。運用現(xiàn)代分析方法對特定時間內(nèi)血液、尿液、唾液等體內(nèi)代謝物的定性、定量進行多參數(shù)檢測分析[11]，目前已運用于臨床診斷、新藥研發(fā)、 藥物有效性、安全性評價、器官移植排斥反應(yīng)以及植物和微生物等領(lǐng)域[12-13]。但代謝組學(xué)在臨床上應(yīng)用較少且受到一定限制，尚處于病因?qū)W探索階段，但其特異性、敏感性的優(yōu)勢，為各種疾病的診斷和機制的研究提供新視角，具有巨大的潛力。

代謝組學(xué)方法包括核磁共振譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)兩種。后者包括氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)等[14]。這些檢測方法各有針對性及優(yōu)缺點，可用于多種化學(xué)類別的綜合代謝組學(xué)分析，應(yīng)根據(jù)研究目的、樣本類型以及實驗室條件等因素進行選擇[15]。NMR具有重復(fù)性高、代謝物易于識別和無損傷性等優(yōu)點，但其監(jiān)測的分辨率和靈敏度較低，體液標(biāo)本中可檢測出的代謝物一般小于100 個[16]。MS 技術(shù)靈敏度、選擇性較高，結(jié)構(gòu)識別性更佳，但分析之前需要經(jīng)GC-MS或LC-MS 分離以降低復(fù)雜性，此過程導(dǎo)致穩(wěn)定性降低，可能改變代謝物的結(jié)構(gòu)，造成結(jié)果偏差[17]。通過代謝組學(xué)技術(shù)分析得到的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過主成分分析法、偏最小二乘判別分析法等預(yù)處理后，獲取所需的生物學(xué)信息，包括生物表型及標(biāo)志物等，檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫、分析原始數(shù)據(jù)、獲取差異代謝物和分析代謝通路等[18]。

2 代謝組學(xué)分析技術(shù)在慢性腎臟病研究中的應(yīng)用

2.1 闡釋發(fā)病機制研究發(fā)現(xiàn)，CKD的發(fā)生與內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活以及炎性趨化因子的表達，從而導(dǎo)致進行性腎間質(zhì)纖維化、腎小管周圍毛細血管丟失以及腎小管萎縮導(dǎo)致的功能性腎單位破壞等有關(guān)[19-20]，同時伴隨著機體脂類代謝、氨基酸代謝、能量代謝以及腸道微生物代謝等代謝功能異常。脂質(zhì)是生物膜的基本成分，對細胞膜的穩(wěn)定性和完整性至關(guān)重要，CKD的發(fā)生也與脂肪酸、甘油磷脂、花生四烯酸代謝通路等有關(guān)[21-22]。腎臟纖維化模型大鼠的血清代謝產(chǎn)物中鑒定出 15 種潛在的生物標(biāo)志物(主要為磷脂和脂肪酸[23])，提示腎臟纖維化可能與脂質(zhì)代謝紊亂造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。以Thy1-1誘導(dǎo)系膜增生性腎炎伴或不伴半腎切除模型大鼠與空白組大鼠比較發(fā)現(xiàn)，模型大鼠尿液中多不飽和脂肪酸或其氧化代謝物如環(huán)氧十八烯酸、環(huán)氧二十碳四烯酸以及α-亞麻酸等升高[24]，可參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，導(dǎo)致CKD發(fā)生發(fā)展。腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎病模型大鼠血清中二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoicacid，DPA)、馬尿酸、亞油酸等脂肪酸氧化中間產(chǎn)物的上調(diào)或下調(diào)，可能引起α-平滑肌肌動蛋白、纖溶酶原激活物抑制物-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1等腎纖維化蛋白高表達，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[25]。研究發(fā)現(xiàn)，血清中DPA、DHA等多不飽和脂肪酸水平的降低與早期腎損傷有關(guān)，而甘油磷脂代謝物如溶血磷脂酰膽堿水平的升高與進展期腎損傷有關(guān)[26]，以上兩種脂代謝紊亂都是通過導(dǎo)致抗炎系統(tǒng)失衡，從而引起CKD發(fā)生發(fā)展。

氨基酸是指含有堿性氨基和酸性羧基的有機化合物，是合成蛋白質(zhì)的基本原料，其分解代謝異?？蓪?dǎo)致機體氨基酸缺乏，影響蛋白質(zhì)合成，造成以白蛋白水平下降的營養(yǎng)不良狀態(tài)以及氨基酸等代謝物升高，引發(fā)蛋白尿，導(dǎo)致腎臟損傷[27]。腎硬化患者體內(nèi)氨基酸分解代謝和合成均減少，其中苯丙氨酸-酪氨酸-多巴胺軸明顯下調(diào)，推測該代謝途徑紊亂與尿液排泄率下降和血壓升高有關(guān)[28]。切除5/6腎致小鼠CKD模型發(fā)現(xiàn)，其血液不對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)和對稱性二甲基精氨酸等精氨酸代謝物水平升高，產(chǎn)生膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子，促進腎臟纖維化，且高水平的ADMA與動脈粥樣硬化程度相關(guān)[29]。阿霉素誘導(dǎo)早期和晚期腎損傷模型大鼠腎臟，脯氨酸代謝基因表達顯著增加，脯氨酸含量升高，晚期腎損傷組上述基因表達上調(diào)更明顯[26]，提示脯氨酸是檢測慢性腎臟病進展的生物標(biāo)志物。檢測200名CKD3～5期患者體內(nèi)極性血漿代謝物發(fā)現(xiàn)，CKD患者血漿中蘇氨酸、蛋氨酸、精氨酸和苯丙氨酸水平低于正常組，其中蘇氨酸、蛋氨酸、精氨酸與基線eGFR無關(guān)[30]，可作為CKD進展的潛在標(biāo)志物。

CKD的發(fā)生發(fā)展還與能量代謝通路有關(guān)。L運用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像技術(shù)，單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral uretera obstruction，UUO)大鼠模型發(fā)現(xiàn)，CKD的發(fā)生與糖酵解、三羧酸循環(huán)、ATP代謝等多種能量代謝通路有關(guān)，其中腎髓質(zhì)，受損區(qū)域的糖酵解代謝產(chǎn)物葡萄糖水平顯著下降，TCA循環(huán)中間體檸檬酸以及富馬酸的前體物質(zhì)琥珀酸顯著增加，導(dǎo)致腎臟能量代謝中斷和線粒體功能障礙，進而活性氧過度產(chǎn)生，通過刺激細胞向成肌纖維細胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腎臟纖維化[31]。

腸道菌群失調(diào)及腸道屏障受損可導(dǎo)致細菌移位、內(nèi)毒素和其他毒素在管腔及循環(huán)中沉積，導(dǎo)致CKD和ESRD中促炎細胞因子/趨化因子級聯(lián)反應(yīng)的激活[32]。腸道菌群分泌的代謝物還可以導(dǎo)致脂質(zhì)、膽汁酸、氨基酸、短鏈脂肪酸等代謝紊亂，從而發(fā)揮腎毒性或腎臟保護潛力[33]。研究發(fā)現(xiàn)，CKD大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的組成改變，blautia、escherichia_shigella、bacteroides、allobaculum和clostridium_IV等13種菌種豐度顯著變化[34]，這些微生物失調(diào)伴隨著甘氨酸代謝途徑的顯著改變。基于毛細管電泳飛行時間質(zhì)譜代謝組學(xué)對腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD模型大鼠血漿、糞便和尿液的代謝物譜進行檢測發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可影響短鏈脂肪酸和氨基酸代謝，導(dǎo)致硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)和對甲酚硫酸酯等尿毒素溶質(zhì)累積，加劇CKD腎損傷[35]。研究對一組不同病情的CKD患者糞便樣本的腸道菌群相關(guān)代謝物分析，發(fā)現(xiàn)晚期CKD患者腸道中的IS和對甲酚硫酸鹽水平顯著升高，蛋類桿菌和普雷沃特氏菌885分別是輕度和重度CKD分類的特異性鑒別菌群，而與疾病進展高度相關(guān)的為迷惑魏氏桿菌和糞紅粉菌的減少和馬西里氏分枝桿菌和甘草酸梭菌的增多[36]。此外，CKD的發(fā)生發(fā)展還涉及嘌呤、?；撬岷痛闻；撬岬榷喾N代謝途徑。

2.2 篩選診斷及預(yù)后標(biāo)志物隨著對慢性腎臟病代謝組學(xué)的深入研究，一系列能指導(dǎo)CKD診斷及判斷預(yù)后的代謝物被發(fā)現(xiàn)，如色氨酸、氧化三甲胺(trimetlylamine oxide，TMAO)、?；鈮A等。IS和5-甲氧基色氨酸(5-MTP)是內(nèi)源性色氨酸代謝物，已被多項研究證明可指導(dǎo)CKD的診斷及預(yù)后。IS也是常見的尿毒癥毒素，由色氨酸經(jīng)腸道色氨酸酶轉(zhuǎn)化為吲哚后被宿主吸收并修飾產(chǎn)生，是CKD患者總體死亡率和心血管死亡率的有力預(yù)測指標(biāo)。在5/6腎切除大鼠的血清中發(fā)現(xiàn)，IS水平隨CKD的進展而升高[37]。研究發(fā)現(xiàn)，IS對CKD的影響是通過上調(diào)干擾素調(diào)節(jié)因子-1的表達來抑制腸上皮細胞中的動力相關(guān)蛋白-1，從而影響線粒體吞噬功能，導(dǎo)致腸黏膜受損[38]。通過敲除腸道擬桿菌的色氨酸酶基因，可抑制吲哚的產(chǎn)生，降低循環(huán)中IS水平，可延緩慢性腎臟病的進展[39]，提示IS與CKD的進展有關(guān)，開創(chuàng)了操縱腸道菌群治療腎臟疾病的新策略。5-MTP是一種色氨酸代謝的5-甲氧基吲哚代謝物，具有抗炎、抗癌、抑制血管重塑的作用。研究發(fā)現(xiàn)，5-MTP水平隨CKD的進展而降低，提示 5-MTP 是檢測早期CKD最具前途的生物標(biāo)志物。5-MTP在UUO小鼠腎臟中降低，5-MTP及降解酶色氨酸羥化酶-1(tryptophan hydroxylase，TPH-1)可通過激活I(lǐng)κB/NF-κB并抑制Keap1/Nrf2信號傳導(dǎo)，進而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[40]，提出TPH-1可作為CKD治療的潛在靶點。

TMAO是L-肉堿和膽堿經(jīng)腸道細菌代謝而成的一種代謝物，可導(dǎo)致或加重全身炎癥反應(yīng)。對CKD3～5期患者及健康受試者空腹血漿樣品中代謝物水平進行比較發(fā)現(xiàn)[41]，CKD透析、非透析患者TMAO水平均高于對照組，且與eGFR呈負相關(guān)，腎移植后TMAO水平恢復(fù)正常，TMAO水平與白細胞介素(interleukin-6，IL-6)、纖維蛋白原、C反應(yīng)蛋白等全身性炎癥反應(yīng)標(biāo)記物呈顯著相關(guān)性，是CKD3～5患者死亡率的獨立預(yù)測因子，推測TMAO可能替代eGFR成為CKD的診斷標(biāo)志物，同樣的結(jié)論在STUBBS[42]的研究中得到證實。

?；鈮A經(jīng)酯化后可經(jīng)肉堿?；d體蛋白作用下進入線粒體內(nèi)完成脂肪酸β-氧化過程，生成ATP細胞正常代謝所需，是細胞內(nèi)能量代謝所必需的物質(zhì)，血液或尿液中檢測到酰基肉堿即表明存在線粒體損傷及血液中?；鈮A的濃度增加。?；鈮A被認(rèn)為是慢性腎臟病心血管損傷的代謝標(biāo)志物，WANG等[43]對1 765例50～70歲基線eGFR≥60 mL·(min·1.73m-2)的成人血漿進行代謝組分析，并經(jīng)過6年的隨訪觀察顯示，基線血漿長鏈?；鈮A的水平與eGFR下降的發(fā)生率呈明顯正相關(guān)。檢測75名未透析的CKD患者的血清和尿液中的肉堿含量發(fā)現(xiàn)，血清中?；鈮A水平隨CKD的進展而增加，與eGFR呈負相關(guān)[44]，推測CKD患者肉堿缺乏導(dǎo)致腎小管細胞損傷，從而導(dǎo)致腎功能障礙的進展。

2.3 在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.3.1 闡釋中藥治療機制 中藥復(fù)方基于整體診斷、個體化及非侵襲性用藥治療原則，已被證明具有良好的抗腎纖維化、預(yù)防及改善并發(fā)癥、延緩腎臟病進展等優(yōu)勢[45-46]。中藥具有多靶點、多途徑、整體調(diào)控等的特點。代謝組學(xué)整體和動態(tài)性研究的特點與中醫(yī)藥的整體觀高度吻合，并逐漸應(yīng)用于中醫(yī)藥相關(guān)研究中[47]。腎炎防衰方可以通過對同型半胱氨酸、L-肉堿、腎上腺素等代謝產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化生長因子β-1的表達進行綜合調(diào)節(jié)，從而改善腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[48]。黃芪丹參湯對CKD大鼠改善腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化的作用可能是通過調(diào)整(E)-油菜素A、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇(130/181)、磷脂酰肌醇(150/203)、磷脂酰絲氨酸和三酰甘油至正常水平而實現(xiàn)的[49]。人參石膏湯可通過調(diào)節(jié)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，煙酸和煙酰胺代謝，色氨酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等4條主要代謝通路異常，提高胰島素敏感性、調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制炎癥反應(yīng)等，從而治療糖尿病腎病[50]。真武湯可調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，改善腸道菌群造成的營養(yǎng)不良狀態(tài)，以及調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi) HIF-1 信號傳導(dǎo)、膽汁分泌、磷酸戊糖和醛固酮合成/分泌等代謝途徑，防止腸上皮屏障的破壞，抑制促炎因子釋放[51]。經(jīng)大黃提取物治療的CKD模型大鼠腸道尿酪胺、苯乙酰甘氨酸、黃嘌呤水平恢復(fù)到正常水平，繼而改善腎間質(zhì)纖維化和炎癥，這不能阻止 CKD 引起的尿液苯丙氨酸、馬尿酸、對甲酚、次黃嘌呤、?；撬岬淖兓痆52]。黃柏皮對阿霉素腎炎大鼠的治療作用主要是恢復(fù)18種異常的代謝物水平，涉及多種氨基酸代謝、二羧酸代謝、類固醇激素生物合成以及乙醛酸等 9條代謝途徑，可降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善腎功能、增強免疫系統(tǒng)功能[53]。

2.3.2 在中醫(yī)辨證分型中的研究 證是證候的簡稱，運用四診合參的方法對疾病某一階段的病因、病位、病性、病機、病勢等病理屬性進行總結(jié)分析、歸納。采用代謝組學(xué)進行臨床證候分型的研究日益增多，已經(jīng)證實中醫(yī)不同證候存在客觀代謝物基礎(chǔ)，與機體糖、脂質(zhì)、氨基酸、能量代謝等方面相關(guān)[54]。CKD以脾腎氣虛證最多見，其次為脾腎氣陰兩虛證及陰陽兩虛證，隨著疾病進展，脾腎氣虛、陰陽兩虛證有上升趨勢[55]。CKD2～3期脾腎氣虛證者血清中甘氨酸、甜茶堿升高，半胱氨酸、谷氨酸、醋酸鹽含量降低，而氣陰兩虛組脂質(zhì)、亮氨酸含量明顯升高，半胱氨酸、谷氨酸、醋酸鹽水平升高，涉及的代謝途徑紊亂為氨基酸、脂質(zhì)、三羧酸循環(huán)等。CKD3～5期脾腎氣虛證及脾腎陽虛證患者的代謝差異主要存在于氨基酸、脂肪酸、鞘脂類等化合物，涉及脂肪酸代謝、氨基酸代謝、鞘脂類代謝及亞油酸代謝[56]。脾腎氣虛證與氣陰兩虛證腹膜透析患者血清中存在明顯的氨基酸分解代謝紊亂，與氣陰兩虛組的氨基酸水平比較，脾腎氣虛組丙氨酸水平較低，甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸水平較高[57]。而在尿液代謝組學(xué)中，慢性腎衰竭早中期脾腎氣虛證型患者甘氨酸、?；撬?、檸檬酸、肌酐、尿素、馬尿酸等生物標(biāo)志物變化顯著，主要涉及牛磺酸、亞牛磺酸代謝以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路[58]。這為CKD的微觀辨證以及中醫(yī)用藥提供了實驗依據(jù)，為中醫(yī)辨證治療CKD提供新的研究途徑。

3 展望

綜上所述，慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展與多個系統(tǒng)、多條代謝通路有關(guān)，代謝組學(xué)為綜合研究腎臟疾病，特別是中醫(yī)分型和治療提供了廣泛的發(fā)展前景和臨床應(yīng)用價值?；诖x組學(xué)的腎臟疾病研究雖然取得了一定進展，但仍存在不足之處：腎臟疾病代謝組學(xué)研究多為動物實驗研究，且多研究慢性腎臟病、糖尿病腎病等疾病，臨床研究特別是中醫(yī)藥臨床研究較少；代謝組學(xué)數(shù)據(jù)量龐大，代謝分子性質(zhì)復(fù)雜，缺乏公認(rèn)的數(shù)據(jù)平臺；多數(shù)生物標(biāo)記物僅處于初步篩查階段，缺乏系統(tǒng)分析和臨床驗證；方藥加減、劑量改變均可造成代謝物的變化，難以系統(tǒng)統(tǒng)計。今后，應(yīng)對不同腎臟疾病的不同分型進行深入研究，為疾病的早期診斷、指導(dǎo)治療提供依據(jù)；應(yīng)科學(xué)設(shè)計臨床研究，擴大樣本量，重點開展中藥單藥、經(jīng)方、經(jīng)驗方治療不同分型腎臟疾病的研究。隨著代謝組學(xué)研究技術(shù)的不斷進步，其在臨床及臨床前研究中的應(yīng)用也將更為廣泛和深入，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用，為CKD發(fā)生發(fā)展及診斷提供新的研究思路和方向。