HS-SPME-GC-MS分析西林火姜揮發(fā)性香氣成分

張璐璐，王后政，劉慧勤，吳建文，黎貴卿，陸順忠，李秋庭*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧530002）

西林火姜又名細(xì)肉姜、小黃姜，根、莖、皮、肉皆為淡黃色，肉質(zhì)致密，姜香濃郁，辛辣味濃，益脾胃、除濕消痞、止咳祛痰的功效優(yōu)良，是良好的香辛調(diào)味料和傳統(tǒng)中醫(yī)藥材，也是廣西百色市西林縣著名特產(chǎn)，已被評(píng)為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品[1-3]?；鸾鳛槲髁挚h重要的經(jīng)濟(jì)作物，年種植面積一般在3 333 公頃左右，總產(chǎn)量約12.5 萬(wàn)噸，目前基本以干姜塊（片）初級(jí)產(chǎn)品遠(yuǎn)銷俄羅斯、日本等國(guó)[4]。

香氣作為生姜香辛料的重要品質(zhì)屬性之一，對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)、加工工藝改良以及開(kāi)發(fā)前景均有重要意義，因此，一直是生姜的研究熱點(diǎn)[5-6]。其中，頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HSSPME）因具有操作簡(jiǎn)單快捷、可避免非揮發(fā)成分污染色譜柱和方法重現(xiàn)性好，以及可結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）進(jìn)一步分析等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于研究生姜香氣成分[7]。2015 年，楊小金等[8]使用65 μm PDMS/DVB 萃取頭在加熱至100 ℃的干姜粉中萃取平衡10 min，鑒定出42種揮發(fā)性成分，主要包括單萜及倍半萜、烯烴、醛類、醇類、酯類、酮類及脂肪烴類化合物。2017 年，LUO 等[9]通過(guò)該法測(cè)定了鮮仔姜的主要成分為香葉醇、乙酸香葉酯、β-紅沒(méi)藥烯、β-倍半水芹烯、β-水芹烯、姜烯和α-法呢烯等。另外，研究發(fā)現(xiàn)HS-SPME 萃取結(jié)果受萃取頭、樣品量、樣品濃度、萃取溫度和萃取時(shí)間以及解析時(shí)間等因素影響[10-11]。2018 年，袁華偉等[12]采用65 μm PDMS/DVB 萃取頭以總峰面積和峰數(shù)對(duì)生姜HSSPME 的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，得出在50 ℃下萃取30 min效果最佳，共檢測(cè)到73 種揮發(fā)性成分，其中萜烯類54種（88.51%），醇類5 種（2.83%），醛類6 種（7.68%），醚類4 種（0.32%），酮類2 種（0.31%），其它2 種（0.059%）。

西林火姜是生姜的地方品種之一，為了了解其香辛特色成分，本文采用頂空固相微萃取方法研究西林火姜的揮發(fā)性香氣成分，通過(guò)對(duì)萃取頭、萃取時(shí)間以及解析時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)確立最佳萃取條件，并結(jié)合匹配度和保留指數(shù)進(jìn)行定性，以期更好和更準(zhǔn)確地反映西林火姜的香氣成分，為西林火姜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西林火姜干姜片：西林縣富源植物開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)提供，于2018 年12 月份中旬采收火姜，經(jīng)熱風(fēng)干燥制成干姜片。主要加工工藝參數(shù)為：溫度60℃～80℃，時(shí)間8 h。

MND-628 多功能養(yǎng)生料理機(jī)：中山市曼能達(dá)塑膠制品有限公司；萃取頭（100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm PA）、手動(dòng)進(jìn)樣手柄：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Scion.TQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)布魯克道爾頓公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)性香氣成分萃取

西林火姜干姜片粉碎，過(guò)40 目篩得干姜粉。稱取干姜粉3 g 于15 mL 頂空瓶中，聚四氟乙烯隔墊密封，老化萃取纖維頭（85 μm PA：老化溫度280 ℃，老化時(shí)間0.5 h；50/30 μm DVB/CAR/PDMS：老化溫度270 ℃，老化時(shí)間1 h；100 μm PDMS：老化溫度250 ℃，老化時(shí)間0.5 h）將其懸于頂空瓶中，在28 ℃下吸附一段時(shí)間后，快速插入250 ℃的GC-MS 進(jìn)樣口，解析一段時(shí)間，進(jìn)行GC-MS 檢測(cè)分析。對(duì)萃取頭、萃取時(shí)間和解析時(shí)間進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，優(yōu)化指標(biāo)為定性揮發(fā)性香氣成分的總峰面積和峰數(shù)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.2 萃取頭的優(yōu)化

萃取頭對(duì)HS-SPME 效果的影響最大，不同的材料和厚度涂層，其極性會(huì)存在一定差異，萃取結(jié)果也明顯不同[13]。研究表明，生姜的揮發(fā)性成分主要由萜烯類組成[14-16]。因此，分別選用100 μm PDMS（適用于小分子揮發(fā)性非極性物質(zhì)）、50/30 μm DVB/CAR/PDMS（適用于C3～C6 大范圍分析）、85 μm PA（適用于極性半揮發(fā)物質(zhì)，酚類）3 種萃取頭，萃取30 min，解析3 min 進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 萃取時(shí)間的優(yōu)化

萃取頭存在萃取平衡狀態(tài)，因此HS-SPME 分析不同的揮發(fā)性有機(jī)物時(shí)，所需時(shí)間不同。萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致出峰分離度差，甚至質(zhì)譜檢測(cè)器過(guò)飽和，影響定性定量；萃取時(shí)間過(guò)短，不能全面準(zhǔn)確反映成分組成。一般情況下10 min 之內(nèi)可達(dá)最高吸附量，而對(duì)于復(fù)雜及半揮發(fā)性有機(jī)物，30 min 至60 min 才能達(dá)到平衡[17]?；鸾銡獬煞謴?fù)雜，因此，使用確定的最佳萃取頭，分別萃取干姜粉30、40、50、60 min，解析3 min進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 解析時(shí)間的優(yōu)化

萃取頭HS-SPME 萃取完成后，需要在GC 進(jìn)樣口解析進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度較高且恒定，解析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能對(duì)萃取頭涂層產(chǎn)生破壞，縮短使用壽命。反之解析時(shí)間過(guò)短，則不能完全解析，不僅會(huì)降低GC-MS 分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可能污染后續(xù)試驗(yàn)[18-19]。因此，使用已確定最佳萃取頭和萃取時(shí)間，分別解析1、2、3、4 min進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 GC-MS 條件

1.2.5.1 GC 條件

色譜柱型號(hào)BR-5ms（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min，最后以20 ℃/min 升溫至250 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣：高純氦氣，純度99.999%，分流比1 ∶10，流量1.20 mL/min，柱壓為2.4 kPa。

1.2.5.2 MS 條件

電離方式EI，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，電子倍增管電壓為800 V，掃描間隔1 s，掃描范圍（m/z）30 ～550。

1.3 數(shù)據(jù)處理

定性方法：采用譜庫(kù)檢索與保留指數(shù)相結(jié)合的方法。（1）質(zhì)譜鑒定：通過(guò)與NIST11 譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，要求正、反匹配度都大于800；（2）保留指數(shù)（retention index，RI）鑒定：C8～C40 的正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)液，采用相同的氣質(zhì)升溫程序，根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算樣品中化合物的保留指數(shù)，并與文獻(xiàn)中使用相同氣相色譜柱的同種物質(zhì)保留指數(shù)進(jìn)行比較確認(rèn)。保留指數(shù)計(jì)算公式如下。

式中：Tx為化合物X 的保留時(shí)間，min；Z 和Z+1 分別為化合物X 出峰前后相鄰正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的碳原子數(shù)；TZ與TZ+1分別為Z 和Z+1 個(gè)碳原子對(duì)應(yīng)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min。

定量方法：面積歸一法。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取頭的優(yōu)化結(jié)果

干姜粉經(jīng)不同萃取頭萃取所得的總峰面積和峰數(shù)如表1 所示。

表1 不同萃取頭對(duì)HS-SPME 萃取效果的影響Table 1 Extraction efficiencies of HS-SPME with different SPME fibers

由表1 可知，不同的萃取頭對(duì)干姜粉的萃取效果不同。其中，萃取頭100 μm PDMS 萃取干姜粉所得總峰面積最大，峰數(shù)最多，萃取效果明顯高于其它兩種萃取頭。因此，確定100 μm PDMS 為最佳萃取頭。

2.2 萃取時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

干姜粉使用100 μm PDMS 萃取頭在不同萃取時(shí)間下所得的總峰面積和峰數(shù)如圖1 所示。

圖1 萃取時(shí)間對(duì)HS-SPME 萃取效果的影響Fig.1 Extraction efficiencies of HS-SPME with different extraction time

由圖1 可知，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取干姜粉所得總峰面積不斷增加，經(jīng)單因素分析，30 min 與40 min的總峰面積存在差異，40 min 與50、60 min 均不存在差異。而萃取所得峰數(shù)在30 min ～40 min 增加，40 min時(shí)峰數(shù)最大，40 min ～60 min 持續(xù)減少，這可能是由于萃取頭在達(dá)到萃取飽和狀態(tài)后，繼續(xù)增加萃取時(shí)間，導(dǎo)致樣品瓶中低沸點(diǎn)高含量的香氣成分與高沸點(diǎn)低含量的香氣成分競(jìng)爭(zhēng)吸附，使得總峰面積在持續(xù)增加而峰數(shù)降低。因此綜合考慮，確定40 min 為干姜粉的最佳萃取時(shí)間。

2.3 解析時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

干姜粉使用100 μm PDMS 萃取頭，萃取40 min，發(fā)現(xiàn)1 min ～4 min 的解析時(shí)間對(duì)峰數(shù)變化無(wú)影響，均為45 個(gè)色譜峰，而對(duì)總峰面積影響較大，如圖2所示。

圖2 解析時(shí)間對(duì)HS-SPME 萃取效果的影響Fig.2 Extraction efficiencies of HS-SPME with different desorption time

由圖2 可知，解析時(shí)間在1 min ～3 min 所得總峰面積一直處于上升趨勢(shì)，4 min 時(shí)有所降低，證明3 min時(shí)已基本解析完全，因此，確定3 min 作為干姜粉的最佳解析時(shí)間。

2.4 西林火姜揮發(fā)性香氣成分的分析

西林火姜干姜粉3 g，在100 μm PDMS 萃取頭，萃取40 min，解析3 min 的最佳萃取條件下，所得香氣成分總離子流圖如圖3 所示。

由圖3 可知，在最佳條件下，西林火姜干姜揮發(fā)性香氣成分基線平穩(wěn)，峰型尖銳且無(wú)過(guò)飽和狀態(tài)。對(duì)揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行檢索結(jié)合保留指數(shù)定性，并計(jì)算相對(duì)百分含量，匯總結(jié)果如表2 所示。

圖3 干姜揮發(fā)性香氣成分的GC-MS 總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion current chromatogram of volatile aroma components extracted from ginger

表2 干姜揮發(fā)性香氣成分的GC-MS 鑒定結(jié)果及相對(duì)百分含量Table 2 Identification results and relative percentage of volatile aroma components of dried ginger

續(xù)表2 干姜揮發(fā)性香氣成分的GC-MS 鑒定結(jié)果及相對(duì)百分含量Continue table 2 Identification results and relative percentage of volatile aroma components of dried ginger

由表2 可知，西林火姜干姜中檢測(cè)出45 種揮發(fā)性香氣成分，萜烴類化合物共23 種是干姜中最豐富的香氣成分，含量高達(dá)91.96%，這類化合物一般具有一定的香氣。其次醇類11 種、醛類3 種、酯類3 種、酮類4 種，含量由高到低為醇類（2.91%）＞醛類（2.11%）＞酯類（0.94%）＞酮類（0.61%），這些香氣成分中大部分為萜烴通過(guò)氧化作用形成的產(chǎn)物，擁有更為復(fù)雜的香氣[20]。除此之外，還檢測(cè)到少量環(huán)氧化物，含量為1.48%。這些物質(zhì)相互協(xié)同增效，賦予了西林火姜濃郁的辛香特色。

在這些物質(zhì)中姜烯（42.09%）、β-倍半水芹烯（15.40%）、（E，E）-α-法呢烯（9.70%）、β-紅沒(méi)藥烯（8.21%）、α-姜黃烯（6.66%）、β-蓽澄茄油烯（2.85%），2-茨醇（1.36%）、α-檸檬醛（1.17%）、β-欖香烯（1.13%）等為主要揮發(fā)性香氣成分，對(duì)西林火姜的香氣有重要貢獻(xiàn)，并且這些香氣成分許多已被證明具有一定的抗氧化、抗菌、促進(jìn)其它治療物質(zhì)的吸收和利用的作用[21-22]。尤其是姜烯、姜黃素、β-倍半水芹烯等在抗炎、抗菌、抗病毒、抗增殖、抗腫瘤等方面具有良好的療效，是醫(yī)藥、食品、香料和化妝品工業(yè)的重要原料[23-24]。另外，對(duì)比西林火姜與其它生姜的香氣成分發(fā)現(xiàn)，它們的物質(zhì)組成具有一定相似性，含量有較大不同，其中姜烯、姜黃素、β-倍半水芹烯的百分含量明顯高于楊小金等[8]、袁華偉等[12]的生姜研究結(jié)果，這可能是西林火姜姜香濃郁，辛辣味濃和藥用性能好的原因。

3 結(jié)論

本研究確立了HS-SPME-GC-MS 分析西林火姜香氣成分的最佳萃取條件為：3 g 干姜粉，采用100 μm PDMS 萃取頭、萃取時(shí)間40 min，解析時(shí)間3 min，在此條件下，結(jié)合匹配度與保留指數(shù)共定性出萜烴類、醇類、醛類、酮類和酯類等45 種香氣成分。西林火姜干姜片揮發(fā)性香氣成分豐富，姜烯、β-倍半水芹烯、（E，E）-α-法呢烯、β-紅沒(méi)藥烯、α-姜黃烯、β-蓽澄茄油烯、2-茨醇、α-檸檬、β-欖香烯為主要揮發(fā)性香氣成分，尤其姜烯、姜黃素、β-倍半水芹烯百分含量明顯高于其他生姜，這些成分可能對(duì)西林火姜的香辛特色具有重要意義。