總峰面積對(duì)糖化血紅蛋白結(jié)果的影響及其2種方法的比較*

張 偉，湯學(xué)彪，胡江紅，付魏萍，汪永強(qiáng)，袁平宗

(四川省內(nèi)江市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 641100)

糖化血紅蛋白儀D-10在分析通路中將分離的血紅蛋白經(jīng)光感測量計(jì)在415 nm處測量，經(jīng)臨床數(shù)據(jù)處理軟件(CDM)收集還原得到色譜流出曲線圖(簡稱色譜圖)，其縱坐標(biāo)為檢測器的響應(yīng)信號(hào)，橫坐標(biāo)為時(shí)間、體積或距離。利用高斯函數(shù)(EMG)通過微積分可計(jì)算糖化血紅蛋白(HbA1c)對(duì)應(yīng)的峰面積占血紅蛋白總峰面積的百分比。但實(shí)際使用中常會(huì)出現(xiàn)小于1 M而報(bào)信號(hào)的情況，其對(duì)應(yīng)的檢測結(jié)果可能并不真實(shí)，需要提高總峰面積進(jìn)行復(fù)查。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室則依據(jù)儀器說明采用稀釋模式(即5 μL全血+1.5 mL稀釋液)進(jìn)行復(fù)查，本實(shí)驗(yàn)室常根據(jù)血紅蛋白水平采用低速離心或自然沉降后按吸去多余比例的血漿，經(jīng)再次重新混勻全血而達(dá)到提高血紅蛋白(Hb)水平并增加總峰面積的效果，有效避免了預(yù)稀釋帶來的基質(zhì)效應(yīng)。2種處理方法均有提高總峰面積的作用，但提高多少不盡相同。且不同總峰面積所對(duì)應(yīng)結(jié)果的差異也未知?，F(xiàn)通過觀察不同總峰面積下峰異常發(fā)生率及對(duì)檢測結(jié)果的影響，探討2種處理方法能否滿足日常檢測要求及其差異，為提高HbA1c檢測質(zhì)量及標(biāo)準(zhǔn)化提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將一個(gè)試劑包使用期間所有符合要求的患者標(biāo)本數(shù)據(jù)納入回顧性分析，包括原管標(biāo)本和總峰面積小于1 M時(shí)2種復(fù)查處理方法的標(biāo)本。采用EDTA-K2抗凝標(biāo)本，出現(xiàn)凝塊時(shí)需病房重新抽取。根據(jù)《糖化血紅蛋白實(shí)驗(yàn)室檢測指南》要求，本實(shí)驗(yàn)室每日高低值質(zhì)控均符合質(zhì)量指標(biāo)(≤靶值±0.3% HbA1c)時(shí)進(jìn)行標(biāo)本檢測。依據(jù)儀器操作規(guī)程中對(duì)結(jié)果可接受性的要求，排除有異常血紅蛋白HbC和HbS，以及HbF≥10%的標(biāo)本，同時(shí)排除易生成甲?；t蛋白的腎衰竭患者標(biāo)本[1]。峰異常是指基線漂移和滯留時(shí)間異常，如A1c和A0峰未出現(xiàn)在正確的窗口處或LA1c-1峰面積大于4.0%或LA1c-2峰面積大于3.5%，以及A0峰前大于或等于2個(gè)unknown峰，或A0峰后出現(xiàn)variant-window及其他峰等干擾A1c峰計(jì)算的情況。

1.2方法 (1)糖化血紅蛋白儀D-10的一個(gè)試劑包使用期內(nèi)，每日保證室內(nèi)質(zhì)控符合質(zhì)量指標(biāo)要求，且每日標(biāo)本先全部原管進(jìn)樣，如果有標(biāo)本量偏少的原管可在管槽底墊上1～2個(gè)專用橡膠墊。由于紅細(xì)胞沉降率過快而導(dǎo)致加樣失敗無結(jié)果的標(biāo)本須混勻后重新進(jìn)樣。出現(xiàn)總峰面積小于1 M的標(biāo)本時(shí)，需按2種處理方法進(jìn)行復(fù)查：一種是將標(biāo)本充分混勻后按手工稀釋模式(5 μL標(biāo)本+1.5 mL wash/dilution液)上機(jī)重測；一種是原管1 500 r/min離心2 min后，棄去一定量的上層血漿并混勻上機(jī)測試，即全血處理模式。吸走的血漿量根據(jù)劉世文等[2]研究結(jié)果：Hb<50 g/L的標(biāo)本吸走800 μL血漿，50～65 g/L吸走500 μL，>65 g/L吸走200 μL。如果仍然出現(xiàn)總峰面積小于1 M可繼續(xù)1 500 r/min離心2 min后吸走100～200 μL血漿混勻上機(jī)，直到總峰面積大于或等于1 M，標(biāo)本量過少仍然采用墊橡膠墊的方法。而手工稀釋模式則注意wash/dilution液從冰箱取出后需恢復(fù)至室溫使用，總峰面積仍小于1 M時(shí)可視情況增加標(biāo)本量重新稀釋上機(jī)。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)符合要求的標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析。分析每個(gè)數(shù)據(jù)的色譜圖并記錄總峰面積、HbA1c值及有無峰異常等數(shù)據(jù)。(2)計(jì)算原管進(jìn)樣標(biāo)本中總峰面積小于1 M的出現(xiàn)率，比較原管標(biāo)本中總峰面積小于1 M與大于或等于1 M標(biāo)本的峰異常率。將前者分為峰異常組和無峰異常組并以與全血處理模式的值偏倚小于或等于0.3% HbA1c為質(zhì)量指標(biāo)[1,3]。比較2組總峰面積和指標(biāo)符合率的差異。(3)分別比較全血處理模式及手工稀釋模式與總峰面積小于1 M標(biāo)本的峰異常率，并比較2種處理方法間總峰面積和HbA1c值的差異。

2 結(jié) 果

2.1原管進(jìn)樣峰異常發(fā)生率結(jié)果比較 納入該研究的原管進(jìn)樣標(biāo)本數(shù)257例，其中有5例標(biāo)本因紅細(xì)胞沉降率過快導(dǎo)致無結(jié)果。經(jīng)再次充分混勻進(jìn)樣最終有56例總峰面積小于1 M標(biāo)本，占21.79%?？偡迕娣e小于1 M的標(biāo)本有8個(gè)出現(xiàn)峰異常，異常率14.29%；總峰面積大于或等于1 M的標(biāo)本有2例出現(xiàn)峰異常，異常率1.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.688，P<0.05)。見表1。

表1 原管總峰面積小于1 M和大于或等于1M的峰異常率結(jié)果比較

2.2峰異常與總峰面積大小和質(zhì)量指標(biāo)符合率的相關(guān)性 將總峰面積小于1 M標(biāo)本分為峰異常組和無峰異常組，峰異常組總峰面積(454 224±174 139)，質(zhì)量指標(biāo)符合率(2/8,25.0%)；無峰異常組總峰面積(656 782±161 523)，質(zhì)量指標(biāo)符合率為(40/48,83.3%)。兩者總峰面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；質(zhì)量指標(biāo)符合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.32種處理方法對(duì)峰異常的影響結(jié)果比較 全血處理模式與手工稀釋模式均發(fā)現(xiàn)1例峰異常，且為同一標(biāo)本，異常率均為(1/56,1.79%)，兩者峰異常率低于原管進(jìn)樣總峰面積小于1 M的標(biāo)本(P=0.016，P<0.05)。見表2。

2.42種處理方法總峰面積和HbA1c值結(jié)果比較 全血處理模式總峰面積(1 331 550±187 418)，HbA1c值(8.2±2.6)%；手工稀釋模式總峰面積(2 094 057±493 850)，HbA1c值(8.3±2.6)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2種處理模式所有標(biāo)本結(jié)果中最大偏倚值為0.2% HbA1c，符合質(zhì)量指標(biāo)要求。見圖1。

表2 2種處理方法與峰面積小于1 M標(biāo)本峰異常率結(jié)果比較(n)

圖1 2種處理模式總峰面積和HbA1c值結(jié)果比較

3 討 論

HPLC法測定HbA1c是采用的歸一化法，該法特點(diǎn)是所有出峰情況全部匯于色譜圖上計(jì)算A1c峰占總峰面積的百分比。D-10糖化血紅蛋白儀要求總峰面積須在1～4 M，偏低和偏高都可能使結(jié)果不能被接受。其中總峰面積偏高的情況除去手工稀釋模式不按標(biāo)準(zhǔn)操作外基本不會(huì)遇到，而總峰面積偏低是實(shí)驗(yàn)經(jīng)常遇到的問題。本研究總峰面積小于1 M的比例就高達(dá)21.79%，這主要是因?yàn)闃?biāo)本量不足及Hb水平偏低和/或紅細(xì)胞沉降過快，總之可以歸結(jié)為樣品針加入了低Hb導(dǎo)致。D-10糖化血紅蛋白儀一次可進(jìn)樣10例標(biāo)本，但無自動(dòng)混勻功能，如果有紅細(xì)胞沉降率過快的標(biāo)本或置于標(biāo)本后幾個(gè)孔位，極易導(dǎo)致低總峰面積甚至無結(jié)果，本研究257例標(biāo)本出現(xiàn)了5例標(biāo)本由于紅細(xì)胞沉降率過快而無結(jié)果，而臨床檢測的大部分低Hb標(biāo)本是因?yàn)榛颊叩牡脱t蛋白癥引起。范秀芳等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者多有貧血，其中糖尿病腎病患者更易發(fā)生貧血且貧血程度較重。賈連玲等[5]將糖尿病合并貧血組與單純糖尿病組進(jìn)行比較，Hb和HbA1c水平均明顯降低(P<0.01)。歸其原因，不排除紅細(xì)胞生存周期縮短而導(dǎo)致HbA1c假性降低，但從實(shí)驗(yàn)本身則疑似樣品針加入低水平Hb引起低總峰面積而致使HbA1c值偏低，正如本研究全血處理模式和手工稀釋模式進(jìn)行比較，總峰面積和HbA1c值同時(shí)偏低(P<0.05)，提示總峰面積的高低會(huì)影響HbA1c值的差異，即引起系統(tǒng)誤差。

本研究總峰面積小于1 M峰異常率顯著增大，從而出現(xiàn)峰異常組質(zhì)量指標(biāo)符合率顯著低于無峰異常組，這可能是峰異常引起隨機(jī)誤差增大所致。而峰異常主要表現(xiàn)為無峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對(duì)稱等情況，其均會(huì)影響色譜分析結(jié)果，可能與方法學(xué)有關(guān)[6]。因?yàn)镠b中某些微量成分或其他雜質(zhì)可能表現(xiàn)為雜峰或未知峰，當(dāng)總峰面積滿足一定的大小時(shí)其影響較小，但總峰面積偏低時(shí)其影響效果會(huì)被隨之放大。其次，A1c峰往往與前HbA1c(西弗氏堿) 或氨基乙酰化的Hb峰有一部分交錯(cuò)重疊，通過微積分將類高斯對(duì)稱峰加以修正并計(jì)算結(jié)果，當(dāng)總峰面積偏低后其分辨率也可能相對(duì)降低而導(dǎo)致分析和計(jì)算誤差。馮仁豐[7]解釋異常Hb對(duì)HbA1c的干擾原理，總峰面積作分母，包括所有峰，出現(xiàn)異常峰后分母的數(shù)字被放大，導(dǎo)致最后計(jì)算得到HbA1c值縮小。另外本實(shí)驗(yàn)獲得的峰異常組總峰面積和指標(biāo)符合率均顯著低于無峰異常組(P<0.05)，同時(shí)表1和表2顯示峰異常率增加與總峰面積偏低有關(guān)，以及峰異常會(huì)引起檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。

劉世文等[2]對(duì)Hb偏低的處理是將血液濃縮即通過離心→棄掉部分上層血漿→混勻檢測效果明顯，本研究根據(jù)其經(jīng)驗(yàn)實(shí)行不同Hb水平范圍吸取不同量的血漿，充分混勻并及時(shí)加樣防止紅細(xì)胞沉降率過快的影響，同時(shí)禁止過分濃縮以防止高水平Hb進(jìn)入色譜柱縮短其使用壽命。而另一種處理方法則是常規(guī)稀釋模式，<1 M則采用標(biāo)本加量的方法。本研究表明這2種處理方法雖然總峰面積都滿足1～4 M要求，但手工稀釋模式總峰面積明顯大于全血處理模式(P<0.05)，且前者HbA1c結(jié)果大于后者0.1% HbA1c存在系統(tǒng)誤差，該系統(tǒng)誤差對(duì)應(yīng)的均值為8.2% HbA1c；由于HbA1c水平越低該誤差會(huì)越不明顯，所以對(duì)糖尿病診斷界值(≥6.5% HbA1c)而言，2種處理方法的系統(tǒng)誤差會(huì)降低。而高水平HbA1c標(biāo)本往往只作為糖尿病治療效果的監(jiān)測，該誤差也無關(guān)緊要。總之，該誤差符合小于或等于0.3% HbA1c的質(zhì)量指標(biāo)要求，2種處理方法都可采用。但同時(shí)這個(gè)系統(tǒng)誤差的問題也應(yīng)該值得重視，如進(jìn)行儀器間比對(duì)或不同標(biāo)本間結(jié)果比較時(shí)都應(yīng)當(dāng)采取同一種處理方法。

[1]糖化血紅蛋白測定專家共識(shí)委員會(huì)．糖化血紅蛋白測定專家共識(shí)[J]．中華糖尿病雜志，2014，6(12)：853-858．

[2]劉世文，崔海麗，侯云修.高效液相色譜法檢測HbA1c未檢出結(jié)果的原因分析[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，20(9)：2528-2530.

[3]SACKS D B,ARNOLD M,BAKRIS G L,et al.Position statement executive summary:guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus[J].Diabetes Care,2011,34(6):1419-1423.

[4]范秀芳，王嘉佳，刁建輝，等.糖尿病腎病與非糖尿病腎病貧血的對(duì)照研究[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2015,19(24):35-37.

[5]賈連玲,王欣茹,鄧龍華,等.糖尿病合并貧血患者糖化血紅蛋白檢測的臨床意義[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志,2017,20(1):51-53.

[6]龔時(shí)瓊.高效液相色譜分析中異常峰的分析與處理[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010，15(6)：37-38.

[7]馮仁豐.糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化和檢測準(zhǔn)確度現(xiàn)狀(續(xù))[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，28(6)：437-441.