頂空固相微萃取葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的條件優(yōu)化

李媛媛，李德美*，張亞?wèn)|，王 燕，王宗義

（1.北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

揮發(fā)性物質(zhì)影響了葡萄酒的感官特性以及葡萄酒的品質(zhì)特征。在過(guò)去的十幾年中，研究人員從葡萄酒中已經(jīng)鑒定并量化了大約800多種[1-2]，包括醇類，酯類，脂肪酸，酮類，酚類等[3-4]。目前，在進(jìn)行葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)分析時(shí)，需要針對(duì)分析物不同的物理或化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分離和富集[5]，根據(jù)萃取原理可將前處理的方法分為三類，第一類是根據(jù)樣品和萃取溶劑的沸點(diǎn)不同，采用同時(shí)蒸餾萃取法[6]等；第二類是根據(jù)相似相容原理，采用液-液萃取法[7]等；第三類根據(jù)香味物質(zhì)對(duì)固相萃取柱附能力不同，采用固相萃取法[8]等。其中頂空固相微萃取法（headspace-solidphase micro extraction，HS-SPME）是目前被廣泛應(yīng)用于葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)分析研究的萃取方法之一，其具有簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)、無(wú)溶劑、檢出限較低等特點(diǎn)，適用于從葡萄酒中提取和濃縮揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)[9]。

近年來(lái)，對(duì)葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)研究有大量文獻(xiàn)報(bào)道，這些研究主要集中在葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理及影響因素[10-11]和不同萃取方法的萃取效果的對(duì)比研究等[12-13]，但是，關(guān)于優(yōu)化提取條件的研究較少。

本研究選取兩款種植面積最廣的葡萄品種所釀造的葡萄酒：霞多麗干白葡萄酒和赤霞珠干紅葡萄酒，通過(guò)對(duì)頂空固相微萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化后的方法進(jìn)行驗(yàn)證，建立葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定的最佳分析條件，以期為今后葡萄酒研究工作提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2015年霞多麗干白葡萄酒：天瑜酒莊；2016年赤霞珠干紅葡萄酒：煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸丫乒煞萦邢薰荆?2%（V/V）乙醇模擬酒溶液；NaCl、無(wú)水乙醇：北京化工廠；內(nèi)標(biāo)物和三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的詳細(xì)信息見表1。

表1 內(nèi)標(biāo)物和標(biāo)準(zhǔn)品名稱、來(lái)源、純度、定量和定性離子Table 1 Name,source,purity,quantitative and qualitative ions of internal standard and standard substances

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀、DB-5MS毛細(xì)色譜柱（30m×0.32 mm×0.25 μm）、HS-SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄：美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國(guó)Supelco公司；DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪予儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香氣成分分析

樣品前處理：將10 mL酒樣、不同添加量的NaCl、50 μL 2-辛醇內(nèi)標(biāo)物（質(zhì)量濃度為400 mg/L）和磁力轉(zhuǎn)子放入20 mL頂空瓶中，在恒溫加熱磁力攪拌器中平衡10min，經(jīng)過(guò)不同的萃取溫度和時(shí)間后在GC進(jìn)樣口解吸5 min，解吸溫度260 ℃。

色譜條件：初始溫度50 ℃，保持2 min，以4.0 ℃/min升至160 ℃，再以6.0 ℃/min升至250 ℃保持5 min；載氣為氮?dú)猓∟2），流速1 mL/min，無(wú)分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；SCAN全掃描。

定性分析[14]：運(yùn)用計(jì)算機(jī)自帶數(shù)據(jù)庫(kù)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（nationalinstitute ofstandardsand technology，NIST）08.L進(jìn)行檢索和分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，確定化學(xué)成分。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品含量進(jìn)行定量分析。

1.3.2 準(zhǔn)確度檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建：將3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成5個(gè)不同濃度梯度的模擬酒溶液，萃取后進(jìn)行儀器分析得到線性方程（n=3）?；厥章蕼y(cè)定：向12%（V/V）乙醇模擬酒溶液中別加入一定量已知濃度的3種標(biāo)準(zhǔn)品溶液，根據(jù)檢出總值以及加標(biāo)量計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=3）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

依據(jù)頂空固相微萃取技術(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]，選取NaCl添加量、萃取時(shí)間和萃取溫度為單因素試驗(yàn)中的研究因素，以研究其對(duì)葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)獲得總峰面積的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，確定兩款不同的葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)萃取的最佳條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 萃取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factor and levels of response surface experiments for extraction condition optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 NaCl添加量與總峰面積的關(guān)系

按照方法1.3.1，加入1.5 g、2.0 g、2.5 g、3.0 g和3.5 g NaCl，添加量相應(yīng)為0.15 g/mL、0.20 g/mL、0.25 g/mL、0.30 g/mL和0.35 g/mL。在40 ℃條件下萃取30 min，研究不同NaCl添加量與風(fēng)味物質(zhì)總峰面積的關(guān)系，以選取合適的NaCl添加量。結(jié)果見圖1。

圖1 NaCl添加量對(duì)總峰面積的影響Fig.1 Effect of NaCl content on total peak area

由圖1可知，在保持萃取時(shí)間和萃取溫度恒定的條件下，當(dāng)NaCl添加量未超過(guò)0.25 g/mL時(shí)，檢測(cè)出赤霞珠葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積隨著樣品中NaCl添加量的增加而增大，但霞多麗干紅葡萄酒珠葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積隨著樣品中NaCl添加量的增加呈現(xiàn)先下降后增長(zhǎng)的趨勢(shì)，當(dāng)NaCl添加量超過(guò)0.25 g/mL時(shí)，總峰面積不再增加反而降低，這可能是由于樣酒中無(wú)機(jī)鹽達(dá)到飽和狀態(tài)，揮發(fā)性物質(zhì)在葡萄酒中的溶解度不再受無(wú)機(jī)鹽濃度的影響，再加入無(wú)機(jī)鹽也不會(huì)提高檢測(cè)物質(zhì)的揮發(fā)性，甚至可能造成抑制揮發(fā)作用，故總峰面積不增反減。因此，本試驗(yàn)選定樣品中NaCl添加量為0.25 g/mL。

2.1.2 萃取時(shí)間與總峰面積的關(guān)系

萃取時(shí)間選擇25 min、30 min、35 min、40 min、45 min，研究不同萃取時(shí)間與風(fēng)味物質(zhì)總峰面積的關(guān)系，以選取合適的萃取時(shí)間。結(jié)果見圖2。

萃取時(shí)間是指頂空瓶中的樣品、頂部空間和涂層纖維三相之間從萃取開始至達(dá)到平衡所需要時(shí)間，攪拌樣品和加溫等方法均可縮短平衡時(shí)間。針對(duì)不同的萃取樣品，萃取時(shí)間大致為20～50 min，最常用的萃取時(shí)間為30 min[20]，平衡萃取效果，從而選取最佳萃取時(shí)間。

由圖2可知，在保持樣品中NaCl添加量與萃取溫度恒定的條件下，兩款樣品風(fēng)味物質(zhì)總峰面積變化的規(guī)律不同。霞多麗干白葡萄酒萃取時(shí)間在25～35 min范圍時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)先下降后增長(zhǎng)的趨勢(shì)；萃取時(shí)間在35～45 min范圍時(shí)，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；總體而言，在35 min左右時(shí)，峰值達(dá)到最大。赤霞珠干紅葡萄酒萃取時(shí)間在25～45 min范圍時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在萃取時(shí)間為35 min時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積達(dá)到最大值，與霞多麗干白葡萄酒相比，其揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積隨萃取時(shí)間變化而波動(dòng)的趨勢(shì)相對(duì)平穩(wěn)。本試驗(yàn)選取35 min作為萃取時(shí)間，并進(jìn)行下一步分析。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction time on total peak area

2.1.3 萃取溫度與總峰面積的關(guān)系

按照方法1.3.1，加入2 gNaCl，在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃及60 ℃條件下萃取30 min，研究不同萃取溫度與風(fēng)味物質(zhì)總峰面積的關(guān)系，以選取合適的萃取溫度，結(jié)果見圖3。

圖3 萃取溫度對(duì)總峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total peak area

萃取溫度一般在20～60 ℃之間，不宜過(guò)高，以免改變葡萄酒基質(zhì)的原始成分[21]。由圖3可知，在樣品中NaCl添加量與萃取時(shí)間固定時(shí)，兩樣品揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定峰值隨萃取溫度而變化的規(guī)律不同。霞多麗干白葡萄酒萃取溫度在20～40 ℃范圍時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)先下降后增長(zhǎng)的趨勢(shì)；萃取溫度在40～60 ℃范圍時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；總體而言，萃取溫度40 ℃時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)峰面積最大。赤霞珠干紅葡萄酒萃取溫度在20～40 ℃范圍時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，萃取溫度40 ℃時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)峰面積最大。隨著溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)越快，揮發(fā)性物質(zhì)在樣品和涂層纖維中的擴(kuò)散系數(shù)越大，萃取效果越好，但是，溫度過(guò)高則會(huì)使得不易揮發(fā)的大分子物質(zhì)吸附在萃取頭上，易揮發(fā)的小分子物質(zhì)很難吸附在萃取頭上[22]，降低揮發(fā)性物質(zhì)在涂層纖維上的分配系數(shù)。本試驗(yàn)選取40 ℃作為萃取溫度。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 建立模型

利用Design-Expert 8.0.5b設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，12個(gè)析因試驗(yàn)，5個(gè)中心點(diǎn)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 干白、干紅葡萄酒萃取條件優(yōu)化響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology for extraction conditions optimization of dry white and dry red wine

2.2.2 模型顯著性檢測(cè)

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果見表4、表5。并得到初步回歸方程如下：

由表4、表5可知，兩種擬合模型P值均＜0.01，說(shuō)明模型差異極顯著，表明試驗(yàn)方法可行；失擬項(xiàng)均不顯著（P1=0.206＞0.05；P2=0.158＞0.05），說(shuō)明回歸方程擬合度較好，試驗(yàn)誤差比較小。

由表4可知，回歸模型中B、A2、AB、AC對(duì)總峰面積的影響顯著（P＜0.05）；B2、C2、BC對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積的影響極顯著（P＜0.01）。由表5可知，回歸模型中C對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積的影響顯著（P＜0.05）；回歸模型中A、B、A2、B2、C2、BC對(duì)總峰面積的影響極顯著（P＜0.01）。從表4和表5所列的F值大小可知，本試驗(yàn)設(shè)定的三個(gè)影響因素對(duì)兩個(gè)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積影響程度依次為B＞A＞C。

表4 霞多麗干白葡萄酒回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of the regression equation of Chardonnay dry white wine

表5 赤霞珠干紅葡萄酒回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of the regression equation of Cabernet Sauvignon dry red wine

霞多麗干白葡萄酒和赤霞珠干紅葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)萃取時(shí)，NaCl添加量、萃取時(shí)間、萃取溫度三個(gè)因素交互作用對(duì)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定總峰面積的響應(yīng)面及等高線見圖4。由圖4可知，曲線走勢(shì)的坡度越陡，說(shuō)明該因素對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定峰面積的影響越顯著；坡度越平滑，影響則越小，三種因素兩兩交互作用對(duì)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定總峰面積均有一定程度的影響。

圖4 各因素交互作用對(duì)總峰面積影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on total peak area

通過(guò)對(duì)回歸模型進(jìn)行驗(yàn)證，得到霞多麗干白葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)最適萃取條件為NaCl添加量0.259 g/mL，萃取時(shí)間34.17 min，萃取溫度40.35 ℃；赤霞珠干紅葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)萃取時(shí)最適條件為：NaCl添加量為0.256 g/mL，萃取時(shí)間為35.80 min，萃取溫度為39.81 ℃。在此條件下，預(yù)測(cè)總峰面積分別為1.958×1010和1.455×1010。考慮到試驗(yàn)可操作性，選擇NaCl添加量為0.25 g/mL、萃取時(shí)間35 min和萃取溫度40 ℃條件下，實(shí)際總峰面積分別為1.955×1010和1.427×1010。最適條件預(yù)測(cè)總峰面積與實(shí)際總峰面積相近，說(shuō)明優(yōu)化后的萃取條件具有可行性。

2.3 HS-SPME分析方法驗(yàn)證

由表6可知，正己醇、正己酸乙酯和辛酸標(biāo)準(zhǔn)品在利用本試驗(yàn)優(yōu)化的最佳萃取條件下得到的保留時(shí)間相差較小，表明其穩(wěn)定性良好，因此，該萃取條件結(jié)合色譜條件可以較為準(zhǔn)確地對(duì)未知揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

表6 標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率Table 6 Retention time,regression equation,correlation coefficient and recovery of standard

由表6可知，正己醇、正己酸乙酯和辛酸標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)系數(shù)均在0.990以上，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，該方法能很好地對(duì)未知揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量分析。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）反映波動(dòng)的相對(duì)大小，數(shù)據(jù)之間的波動(dòng)性越大，RSD也越大，一般小于2%[23]?；厥章试?8.3%～100.53%范圍內(nèi)，表明該方法準(zhǔn)確度較高。標(biāo)準(zhǔn)品回收率試驗(yàn)的RSD處于0.59%～0.91%范圍內(nèi)，表明數(shù)據(jù)波動(dòng)不大，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)基于HS-SPME-GC-MS方法，對(duì)霞多麗干白葡萄酒和赤霞珠干紅葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化后的萃取條件進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化法獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，兩款樣品均在NaCl添加量為0.25 g/mL，萃取時(shí)間為35 min，萃取溫度為40 ℃的萃取條件下效果最佳。表明此方法具有一定的通用性。通過(guò)對(duì)優(yōu)化的萃取條件進(jìn)行定性和定量試驗(yàn)驗(yàn)證得出，該方法穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度及精確度較高，結(jié)果表明該萃取條件試驗(yàn)效果較好，具有可行性。