2種嫁接番茄根系分泌活性物質(zhì)對番茄青枯病及根際微生物的影響

劉斯晗 鄭旭陽 鐘川 王鵬 陽燕娟 于文進(jìn)

摘要：【目的】鑒定分析嫁接番茄根系分泌物，研究其活性成分對番茄抗青枯病、番茄體內(nèi)青枯菌及根際微生物數(shù)量的影響，為番茄青枯病的防治提供新思路?！痉椒ā恳愿吒星嗫莶》哑贩N粉貝貝（Fb）、高抗青枯病番茄砧木番砧? 1號（No.1）和茄砧21號（No.21）為試驗材料，設(shè)自根嫁接（Fb/Fb）、砧穗嫁接（Fb/No.1、Fb/No.21）和砧木自嫁接（No.1/No.1、No.21/No.21）5個嫁接組合。利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對嫁接番茄接種青枯菌前后的根系分泌物進(jìn)行鑒定分析，用篩選出的活性物質(zhì)對高感病番茄進(jìn)行灌根處理后接種青枯菌，采用稀釋平板法分離測定番茄體內(nèi)和根際青枯菌及根際微生物數(shù)量?！窘Y(jié)果】從嫁接番茄根系分泌物中鑒定篩選出鄰苯二甲酸二甲酯（DP）和2，6-二叔丁基對甲苯酚（BHT）2種活性物質(zhì)，其中1.0 mmol/L DP與1.0 mmol/L BHT混合灌根處理的抗青枯病效果最好，使高感病番茄的青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)顯著降至46.7%、42.5（P<0.05，下同）。2種活性物質(zhì)灌根處理均能使根際微生物總量和細(xì)菌數(shù)量明顯下降;均可降低根際真菌數(shù)量，其中BHT的抑制效果更強(qiáng);均可在發(fā)病初期顯著抑制放線菌的增殖，且DP的抑制效果強(qiáng)于BHT?！窘Y(jié)論】篩選出DP和BHT 2種活性物質(zhì)，其可通過改善根際微環(huán)境、降低植株體內(nèi)和根際的青枯菌數(shù)量而提高番茄對青枯病的抗性。

關(guān)鍵詞： 番茄;嫁接;青枯病;根系分泌物;氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用;根際微生物

中圖分類號： S436.412.15? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3382-10

Effects of active substances secreted from roots of two grafted tomato plants on tomato bacterial wilt and rhizosphere microorganisms

LIU Si-han， ZHENG Xu-yang， ZHONG Chuan， WANG Peng，

YANG Yan-juan， YU Wen-jin*

（College of Agriculture， Guangxi University， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】The purpose of this study was to identify and analyze the root exudates of grafted tomato， and to study the effect of its active components on tomato resistance to bacterial wilt， bacterial wilt bacteria in tomato and the number of rhizosphere microorganisms， so as to provide new ideas for the control of tomato bacterial wilt. 【Method】Tomato varieties with high susceptibility to bacterial wilt disease， Fanbei （Fb）， tomato rootstocks with high resistance to bacterial wilt， Fanzhen No.1 （No.1） and Qiezhen No.21 （No.21） were used as experimental materials. There were five grafting combinations， which wereself-root grafting seedling （Fb/Fb）， rootstock grafting （Fb/No.1， Fb/No.21） and rootstock self-grafting （No.1/No.1， No.21/No.21）. Gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was used to identify and analyze the root exudates before and after inoculation of Ralstonia solanacearum in grafted tomatoes. Hypersusceptible tomatoes roots were treated with selected active substances then were inoculated by R. solanacearum. The dilution plate method was used to isolate and determine the amount of R. solanacearum and rhizosphere microorganisms in tomato and rhizosphere. 【Result】Two active substances， dimethyl phthalate （DP） and 2，6-di-tert-butyl-p-cresol （BHT）， were identified and screened from the root exudates of grafted tomato， among which 1.0 mmol/L DP and 1.0 mmol/L BHT mixed root irrigation treatment had the best disease resistance effect， which significantly reduced the incidence and di-sease index of bacterial wilt in highly susceptible tomato to 46.7% and 42.5 （P<0.05， the same below）. The two active substances in the root irrigation treatment significantly decreased the number of rhizosphere microorganisms and bacteria， both could reduce the number of rhizosphere fungi， in which BHT inhibition was more effective. They could both significantly inhibited number of fungiin the early stage of disease， and DP had better effects than BHT. 【Conclusion】Two active substances， DP and BHT， are screened out， which can improve the resistance of tomato to bacterial wilt by improving the rhizosphere microenvironment and reducing the number of bacterial wilt bacteria in the plant and in the rhizosphere.

Key words： tomato;grafting; bacterial wilt;root exudates;gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）;soil microorganism

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（31660568）; Guangxi Science and Technology Major Special Project（Guike AA17204039-2， Guike AA17204026-1）

0 引言

【研究意義】番茄青枯病是我國華南地區(qū)番茄生產(chǎn)最嚴(yán)重的土傳病害之一，采用抗病砧木嫁接可顯著提高番茄對青枯病的抗性（王岳霞等，2018）。研究表明，用抗病砧木嫁接的番茄植株的根系分泌物具有抑制根際土壤中青枯菌侵染和繁殖的作用（趙文宗，2019）。然而，目前關(guān)于番茄嫁接植株根系分泌物的物質(zhì)成分和含量，以及根系分泌物對嫁接植株的青枯病抗性及作用機(jī)理尚不明確。植物在生長過程中根系會向外部釋放一些無機(jī)離子和有機(jī)化合物來調(diào)節(jié)植株自身生長和影響土壤及土壤微生物，這類由根系釋放的物質(zhì)統(tǒng)稱為根系分泌物（李爭艷等，2021）。根系分泌物的物質(zhì)組成及含量與植株的種類和生長情況、根際受生物或非生物脅迫等因素息息相關(guān)（高游慧等，2021）。根系分泌物的不同組分對土壤結(jié)構(gòu)形成、土壤養(yǎng)分活化、植物養(yǎng)分吸收和環(huán)境脅迫緩解等具有不同的作用（任改弟等，2021）。土壤中聚居有益微生物和病原微生物，植物可通過調(diào)節(jié)土壤微生物來增強(qiáng)自身的營養(yǎng)吸收與利用，或是增強(qiáng)自身的抗病能力。根系分泌物含有豐富的酸、醇和維生素等物質(zhì)，是植物調(diào)節(jié)土壤微生物的重要媒介，為根際微生物的物質(zhì)代謝和能量循環(huán)提供原料，從而影響土壤微生物的種類和數(shù)量在根際的分布（李慧等，2021）。植物根系分泌物對土壤微生物的調(diào)節(jié)和影響作為植株抗病性調(diào)節(jié)的一部分，被越來越多的研究者們所重視。研究嫁接番茄根系分泌物與土壤微生物的關(guān)系，有助于進(jìn)一步揭示抗病砧木嫁接提高番茄青枯病抗性的機(jī)理。【前人研究進(jìn)展】目前對番茄青枯病的防治主要集中于生物防治、農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治三大類（王杰等，2020）。農(nóng)業(yè)防治成本高，周期長;化學(xué)防治對環(huán)境危害大。目前生物防治是青枯病防治的研究熱點，其中新型植物源活性物質(zhì)是重要的方向之一。研究表明，柑橘果肉和海綿組織中可萃取得到生物殺傷性產(chǎn)品Citrofresh，對番茄青枯病的田間防治有極強(qiáng)的效果（曾軍，2012）;大蒜乙酸乙酯提取物對番茄青枯病菌具有很好的抑制效果（張萬萍和趙麗，2012）。大量的研究結(jié)果表明，植株可通過根系分泌物直接抑制病原菌的生長，提高植株的抗病能力（李佳佳等，2020;袁仁文等，2020）。劉娜等（2013）發(fā)現(xiàn)茄子根系分泌物中的月桂醇和2，6-二叔丁基苯醌等物質(zhì)可抑制黃萎病菌的菌絲生長，從而提高茄子對黃萎病的抗性;姜野（2017）發(fā)現(xiàn)西瓜根系分泌物中的棕櫚酸可抑制西瓜轉(zhuǎn)化型尖孢鐮刀菌的生長繁殖，從而降低西瓜枯萎病的發(fā)病率。根系分泌物是植物與土壤及土壤微生物相互作用的主要途徑（劉京偉等，2021），植物可通過根系分泌物調(diào)節(jié)土壤微環(huán)境，從而提高植株的抗病能力（申建波和毛達(dá)如，2011）。劉明（2015）研究發(fā)現(xiàn)，成熟期抗病轉(zhuǎn)基因玉米與普通玉米的土壤細(xì)菌數(shù)量和真菌數(shù)量存在顯著差異，可能與轉(zhuǎn)基因玉米抗性提升有關(guān);采用茄科蔬菜輪作可有效降低高發(fā)枯萎病蕉園土壤中的真菌數(shù)量，提高細(xì)菌和放線菌數(shù)量，從而提高香蕉對枯萎病的抗性（李夢輝，2017）;Boubaker等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，番茄植株被灰霉病菌感染后根系分泌物中的葡萄糖酸水平升高，促進(jìn)病原菌拮抗菌的生長，從而增強(qiáng)植株的抗病性;Yuan等（2018）發(fā)現(xiàn)香蕉根系分泌物中的有機(jī)酸能誘導(dǎo)有益菌增殖和生物膜形成，認(rèn)為酚酸類物質(zhì)含量增高潛在地增強(qiáng)了有益菌在根際的定殖和對病原體的抑制能力。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，嫁接番茄根系分泌物能通過提高根際有益微生物的豐度和抑制病原菌增殖來提高番茄植株的抗病性（趙文宗，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期研究利用乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷等3種有機(jī)溶劑從嫁接番茄根系分泌物中鑒定出鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異辛酯和2，4-二叔丁基苯酚3種具有抗青枯病作用的活性成分（趙文宗，2019），嫁接番茄根系分泌物中是否還存在其他抗青枯病活性成分、活性物質(zhì)對根際微生物種類和數(shù)量的影響等有待進(jìn)一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測定分析不同嫁接番茄處理接種青枯菌前后的根系分泌物，篩選出其中的主要活性物質(zhì)，研究活性物質(zhì)對番茄青枯病的防控效果，并通過稀釋培養(yǎng)法探討活性物質(zhì)對番茄體內(nèi)和根際微生物及病原菌的影響，為番茄青枯病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用嫁接砧木為高抗青枯病的番砧1號（No.1）和茄砧21號（No.21），接穗為高感青枯病番茄品種粉貝貝（Fb），均為本課題組選育的品種。青枯病病原菌（簡稱青枯菌）為本課題組從大田病株中分離保存的強(qiáng)致病性菌株（生理小種Ⅰ）。

培養(yǎng)基：細(xì)菌分離用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）、真菌分離用馬丁氏培養(yǎng)基、放線菌分離用改良高氏1號培養(yǎng)基。青枯菌用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗設(shè)計 試驗于2020年5—10月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜溫室和人工氣候室中進(jìn)行。砧木和接穗苗期管理相同，當(dāng)砧木長至3葉1心時用C型套管貼接法嫁接，共設(shè)自根嫁接（Fb/Fb）、砧穗嫁接（Fb/No.1、Fb/No.21）和砧木自嫁接（No.1/No.1、No.21/No.21）5個嫁接組合。嫁接成活后移栽至營養(yǎng)缽中培養(yǎng)。嫁接植株長至現(xiàn)蕾期時，各嫁接組合取30株番茄苗，用傷根灌注法接種濃度為5×108 CFU/mL的青枯菌液，每株15 mL，以無菌水為對照。接種后置于人工氣候室內(nèi)，用于后續(xù)試驗。

1. 2. 2 根系分泌物收集 每種嫁接苗接種青枯菌前后各處理取長勢一致的10株單株，抖除植株根系大塊基質(zhì)，依次用清水和去離子水洗掉根上附著的雜質(zhì)，用無菌紗布將植株根系吸干后置于裝有500 mL去離子水的遮光燒杯內(nèi)，連續(xù)通氣培養(yǎng)24 h，杯內(nèi)液體即為根系分泌物粗收集液。收集液經(jīng)定性濾紙過濾雜質(zhì)后，用去離子水定容至0.05 g/mL（每毫升收集液中含0.05 g鮮根重的根系分泌物），保存于4 ℃冰箱中備用。試驗重復(fù)3次。

1. 2. 3 根系分泌物GC-MS分析 采用趙文宗（2019）的方法，以500 mL的乙醚作為萃取劑，按體積比1∶1對根系分泌物收集液進(jìn)行萃取。利用GC-MS（Agilent 7890A-5975C）對乙醚萃取的根系分泌物組分進(jìn)行分析。根據(jù)總離子流圖，通過檢索對比譜圖庫NIST08分析各組分中所含物質(zhì)，采用峰面積歸一法確定各物質(zhì)的相對含量。通過比較不同嫁接組合根系分泌物萃取組分中各物質(zhì)的相對含量差異，分析得出可能抑制番茄青枯病的主要活性物質(zhì)。

1. 2. 4 根系分泌物主要活性物質(zhì)防治青枯病試驗

培育高感青枯病番茄幼苗，長至3葉1心時移栽至營養(yǎng)缽中培養(yǎng)7 d，用疑似根系分泌物中抑制番茄青枯病的活性物質(zhì)（DP和BHT）進(jìn)行灌根處理，隨后接種青枯菌，驗證疑似活性物質(zhì)對青枯病的防治效果。

活性物質(zhì)分別設(shè)0.2、0.5、1.0和2.0 mmol/L 4個濃度進(jìn)行單因素試驗，2種活性物質(zhì)以0.2、0.5和1.0 mmol/L 3個濃度相互組合設(shè)9個雙因素處理[DP+BHT的濃度配比分別設(shè)為（mmol/L）：A（0.2+0.2）;B（0.2+0.5）;C（0.2+1.0）;D（0.5+0.2）;E（0.5+0.5）;F（0.5+1.0）;G（1.0+0.2）;H（1.0+0.5）;I（1.0+1.0）]，每處理90株番茄幼苗，試驗重復(fù)3次。每株灌根20 mL溶液，每3 d灌根1次，連續(xù)3次，以無菌水為對照（CK）。灌根結(jié)束7 d后，用傷根灌注法接種濃度為5×108 CFU/mL的青枯菌液，每株15 mL。接種青枯菌后14 d，調(diào)查番茄植株的發(fā)病率和單株病級，計算病情指數(shù)。

番茄青枯病的病情分級參考趙文宗（2019）的方法分為5級：0級，無癥狀;1級，1片葉萎蔫;2級，2～3片葉萎蔫;3級，除植株頂部2～3片葉外，其他葉片均萎蔫;4級，全株葉片萎蔫，植株死亡。

發(fā)病率（%）=發(fā)病株數(shù)/接種總株數(shù)×100

病情指數(shù)=∑（病情級別×該病級株數(shù)）/（病情最

高級別×接種總株數(shù)）×100

1. 2. 5 番茄植株體內(nèi)及根際微生物數(shù)量測定 根際基質(zhì)取樣：分別在接種青枯菌前（S1）和青枯病發(fā)病初期（S2）、發(fā)病高峰期（S3）、發(fā)病末期（S4）取樣。將番茄植株連同基質(zhì)團(tuán)從營養(yǎng)缽倒出，去掉表面1 cm深的基質(zhì)，抖落松散基質(zhì)露出根系，用毛刷取距根表4 mm內(nèi)的基質(zhì)作為根際基質(zhì)。根際基質(zhì)樣品過10目篩后裝入50 mL的無菌離心管中，置于-20 ℃冰箱備用。每處理隨機(jī)取10株，重復(fù)3次。

植株取樣：將各時期取樣的植株剪除主莖0.5 cm以上部分，用去離子水洗凈植株根系附著的基質(zhì)，無菌水沖洗植株根系和主莖，無菌紗布吸干，取根系和主莖各10 g保存于-20 ℃冰箱備用。

微生物培養(yǎng)懸浮液制備：分別取10 g樣品（主莖和根系樣品經(jīng)研磨）放入加有90 mL無菌水的錐形瓶中，密封后置于水平恒溫?fù)u床上30 ℃下200 r/min振蕩30 min，獲得懸浮液，將其進(jìn)行梯度稀釋，用于微生物分離培養(yǎng)。

微生物分離計數(shù)：參照趙文宗等（2019）的方法，采用稀釋平板法分離培養(yǎng)根際基質(zhì)中的細(xì)菌、真菌、放線菌及植株主莖和根系內(nèi)的青枯菌。

取稀釋至10-3、10-4和10-5的根際基質(zhì)及植株主莖和根系懸浮液分別均勻涂布在不同分離培養(yǎng)基上，每處理涂3皿，每皿涂50 ?L，于28 ℃恒溫黑暗條件下分別培養(yǎng)2 d（細(xì)菌和青枯菌）、3 d（真菌）、6 d（放線菌），記錄每皿的菌落數(shù)，換算成每克鮮基質(zhì)、鮮組織（主莖和根系）的菌落平均數(shù)，微生物總量為細(xì)菌、真菌和放線菌的菌落數(shù)量之和。

微生物數(shù)量（CFU/g）=（菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/

[每皿涂樣量×鮮基質(zhì)（或鮮

組織）重]

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010及SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、圖表繪制等處理。

2 結(jié)果與分析

2. 1 番茄嫁接苗根系分泌物的物質(zhì)組成

通過GC-MS檢測嫁接番茄根系分泌物的乙醚萃取組分，分析出烴類、酚類、酯類、醇類、酮類和萘胺類等多種物質(zhì)成分，其中酚類物質(zhì)占比為75.47%～83.89%，脂類物質(zhì)占比為4.92%～12.17%（表1）。相對含量較高的有2，6-二叔丁基對甲苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯、十八烷和1-十六烯等物質(zhì)。其中2，6-二叔丁基對甲苯酚（BHT）在2種砧穗嫁接苗（Fb/No.1、Fb/No.21）中的含量比自根嫁接苗（Fb/Fb）高;鄰苯二甲酸二甲酯（DP）在接種青枯菌后的2種砧穗嫁接苗中的含量比自根嫁接苗（Fb/Fb）高;2，4-二叔丁基苯酚和鄰苯二甲酸二丁酯的含量在2種砧穗嫁接苗接種青枯菌后升高，推測這4種物質(zhì)可能與嫁接番茄抗青枯病有關(guān)。本課題組前期研究（趙文宗，2019）已驗證鄰苯二甲酸二丁酯和2，4-二叔丁基苯酚具有防治青枯病的作用，因此本研究對DP和BHT的防治青枯病效果進(jìn)行驗證。

2. 2 2種活性物質(zhì)對番茄青枯病的防治效果

使用不同濃度的DP和BHT灌根處理后，高感青枯病番茄的抗病性增強(qiáng)，隨著處理濃度的提高，防病效果顯著提高（P<0.05，下同）。DP處理下，低濃度0.2和0.5 mmol/L處理的發(fā)病率及病情指數(shù)均與CK無顯著差異（P>0.05，下同），1.0和2.0 mmol/L處理的發(fā)病率及病情指數(shù)均顯著低于CK，其中2.0 mmol/L處理的效果最好，發(fā)病率和病情指數(shù)分別降至57.7%、48.9（圖1）。BHT處理下，低濃度0.2和0.5 mmol/L處理的發(fā)病率及病情指數(shù)與CK差異不顯著，而1.0和2.0 mmol/L處理的發(fā)病率及病情指數(shù)顯著低于CK和低濃度處理，其中2.0 mmol/L處理的發(fā)病率和病情指數(shù)最低，分別為74.4%和64.4（圖2）。表明2種活性物質(zhì)灌根處理均能提高番茄植株對青枯病的抗性，其中2.0 mmol/L處理的防病效果最好。

由圖3可知，2種活性物質(zhì)適宜濃度混合灌根處理的防病效果較單一物質(zhì)處理好，其中1.0 mmol/L DP+1.0 mmol/L BHT混合處理（I）使青枯病發(fā)病率降至46.7%，病情指數(shù)降至42.5，顯著低于其他處理，防病效果最好。

2. 3 2種活性物質(zhì)對番茄根際和植株體內(nèi)青枯菌數(shù)量的影響

在各發(fā)病時期，2種活性物質(zhì)灌根處理的番茄根際、根系和主莖的青枯菌數(shù)量均低于CK，處理濃度越高，青枯菌數(shù)量越少（圖4）。

各處理番茄根際青枯菌數(shù)量隨著植株病期發(fā)展呈先升高后降低的趨勢，發(fā)病初期的青枯菌數(shù)量最高，發(fā)病末期趨于平穩(wěn)（圖4-A）。發(fā)病初期，除0.2 mmol/L DP和0.2 mmol/L BHT處理外，其余各處理的根際青枯菌數(shù)量均顯著低于CK，1.0 mmol/L DP處理的根際青枯菌數(shù)量最少，為55.625×105 CFU/g，其次為1.0 mmol/L BHT處理，根際青枯菌數(shù)量為62.126×105 CFU/g;發(fā)病高峰期，各處理根際的青枯菌數(shù)量較發(fā)病初期明顯下降;發(fā)病末期，各處理的根際青枯菌數(shù)量與發(fā)病高峰期相比無明顯變化。

各處理根系中的青枯菌數(shù)量少于根際，且變化趨勢與根際存在差異，在發(fā)病高峰期青枯菌數(shù)量達(dá)到峰值（圖4-B）。發(fā)病初期，0.5、1.0 mmol/L的DP和BHT處理的根系青枯菌數(shù)量顯著低于CK，其余處理與CK差異不顯著，其中1.0 mmol/L DP處理的根系青枯菌數(shù)量最少，為16.875×105 CFU/g;發(fā)病高峰期，各處理的根系青枯菌數(shù)量較發(fā)病初期明顯增加，除0.2 mmol/L的DP和BHT處理外，其余處理的青枯菌數(shù)量均顯著低于CK，1.0 mmol/L DP處理的根系青枯菌數(shù)量最少，為22.375×105 CFU/g，顯著低于其他處理;發(fā)病末期，除1.0 mmol/L DP處理外，其余處理的根系青枯菌數(shù)量較發(fā)病高峰期明顯下降。

主莖中的青枯菌數(shù)量少于根系，且變化趨勢與根系相似（圖4-C）。發(fā)病初期，除0.2 mmol/L的DP和BHT處理外，其余處理的青枯菌數(shù)量均顯著低于CK;發(fā)病高峰期，0.2 mmol/L的DP和BHT處理的青枯菌數(shù)量較發(fā)病初期明顯增加，其余處理無明顯變化且顯著低于CK;發(fā)病末期，0.2 mmol/L的DP和BHT處理及0.5 mmol/L BHT處理的青枯菌數(shù)量較發(fā)病高峰期明顯下降，其余處理無明顯變化，0.5和1.0 mmol/L的DP及BHT處理的青枯菌數(shù)量顯著低于CK。

以上結(jié)果說明，在接種青枯菌條件下，2種活性物質(zhì)處理的植株體內(nèi)青枯菌數(shù)量均低于無菌水處理（CK），且青枯菌數(shù)量隨著處理濃度的提高而下降，相同濃度的DP與BHT處理相比，DP處理的青枯菌數(shù)量更少。

2. 4 2種活性物質(zhì)對根際微生物總量的影響

由圖5可知，接種青枯菌前，除0.5 mmol/L DP處理外，其余處理的微生物總量均顯著低于CK，1.0 mmol/L DP處理的根際微生物總量最少，為109.3×106 CFU/g。發(fā)病初期，各處理微生物總量均顯著低于CK，0.5 mmol/L及1.0 mmol/L的DP和BHT處理的根際微生物總量較接種前明顯下降，其中1.0 mmol/L DP處理最低，為74.34×106 CFU/g。發(fā)病高峰期，0.5和1.0 mmol/L DP處理的根際微生物總量較發(fā)病初期明顯增加，0.2 mmol/L BHT處理的根際微生物總量明顯下降，其余處理較發(fā)病初期無明顯變化，且均顯著低于CK。發(fā)病末期，除0.2 mmol/L DP處理較發(fā)病高峰期的根際微生物總量增加外，其余處理的根際微生物總量與發(fā)病高峰期無明顯變化，微生物總量趨于平穩(wěn)。以上結(jié)果表明，2種活性物質(zhì)處理均可降低土壤微生物總量，且在發(fā)病初期高濃度處理后的土壤微生物總量顯著下降。

2. 5 2種活性物質(zhì)對根際細(xì)菌數(shù)量的影響

各處理的根際細(xì)菌變化趨勢與根際微生物總量相似（圖6）。接種青枯菌前，除0.2和0.5 mmol/L DP處理外，其余處理的根際細(xì)菌數(shù)量均顯著低于CK，其中1.0 mmol/L DP處理的根際細(xì)菌數(shù)量最少，為78.93×106 CFU/g。發(fā)病初期，各處理的根際細(xì)菌數(shù)量顯著低于CK，除0.2 mmol/L的DP和BHT處理外，其余處理的根際細(xì)菌數(shù)量較接種前明顯下降，其中1.0 mmol/L DP處理的根際細(xì)菌數(shù)量最少，為54.4×106 CFU/g。發(fā)病高峰期，0.2 mmol/L的DP和BHT處理的根際細(xì)菌數(shù)量較發(fā)病初期明顯下降，其余處理無明顯變化，各處理均顯著低于CK。發(fā)病末期，除0.2 mmol/L DP處理和0.5 mmol/L BHT處理的根際細(xì)菌數(shù)量較發(fā)病高峰期明顯上升外，其余處理無明顯變化。表明2種活性物質(zhì)具有抑制根際細(xì)菌增殖的作用。

2. 6 2種活性物質(zhì)對根際真菌數(shù)量的影響

各處理的根際真菌數(shù)量遠(yuǎn)少于細(xì)菌數(shù)量（圖7）。接種青枯菌前，各處理的根際真菌數(shù)量均顯著低于CK，其中DP處理的根際真菌數(shù)量少于BHT處理。發(fā)病初期，除0.5 mmol/L DP處理外，其余處理的根際真菌數(shù)量均顯著少于CK，DP處理的根際真菌數(shù)量較接種前明顯增加，0.5 mmol/L BHT處理的根際真菌數(shù)量較接種前明顯下降。發(fā)病高峰期，0.2 mmol/L DP處理的根際真菌數(shù)量較發(fā)病初期明顯增加，其余處理的根際真菌數(shù)量較發(fā)病初期明顯下降，其中1.0 mmol/L BHT處理最低，為0.52×106 CFU/g。發(fā)病末期，0.2 mmol/L BHT處理的根際真菌數(shù)量較發(fā)病高峰期明顯增加，0.2 mmol/L DP處理及0.5和1.0 mmol/L BHT處理的根際真菌數(shù)量較發(fā)病高峰期明顯下降，其中0.5和1.0 mmol/L BHT處理的根際真菌數(shù)量顯著低于同時期其他處理。表明2種活性物質(zhì)處理均可降低根際真菌數(shù)量，其中BHT的抑制效果更強(qiáng)。

2. 7 2種活性物質(zhì)對根際放線菌數(shù)量的影響

各處理的根際放線菌數(shù)量變化趨勢與真菌數(shù)量變化趨勢存在差異（圖8）。接種青枯菌前，1.0 mmol/L BHT處理的根際放線菌數(shù)量顯著低于其他處理，其余處理間根際放線菌數(shù)量差異不顯著。發(fā)病初期，1.0 mmol/L BHT處理的根際放線菌數(shù)量較接種前明顯增加，其余處理明顯下降，所有處理均顯著低于CK。發(fā)病高峰期，0.2 mmol/L BHT處理的根際放線菌數(shù)量降至14.93×106 CFU/g，明顯低于發(fā)病初期，0.2和1.0 mmol/L DP處理的根際放線菌數(shù)量較發(fā)病初期明顯增加，其余處理無明顯變化。發(fā)病末期，不同處理根際放線菌數(shù)量較發(fā)病高峰期明顯增加，除0.2 mmol/L BHT處理外，其余處理的根際放線菌數(shù)量均顯著高于CK。

在人工接種青枯菌的條件下，DP和BHT 2種活性物質(zhì)處理均可在發(fā)病初期顯著抑制放線菌的增殖，且DP的抑制效果強(qiáng)于BHT。

3 討論

根系分泌物是土壤中化感物質(zhì)的重要來源，其組成及含量與植株種類和土傳病害抗性息息相關(guān)（Luo et al.，2015）。據(jù)報道，鄰苯二甲酸等具有一定抑菌活性的衍生物普遍存在于茄子的根系分泌物中（周寶利等，2011）。王維華等（2021）發(fā)現(xiàn)在抗線蟲辣椒根系分泌物中含有鄰苯二甲酸二丁酯，而在感病辣椒品種的根系分泌物中未發(fā)現(xiàn)。多種植物根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)也被證實存在抗病作用（周艷麗等，2011;齊永志等，2021）。乙醚是一種優(yōu)良的萃取劑，相較于本課題組前期使用的乙酸乙酯和石油醚（趙文宗，2019），乙醚具有極性低、可萃取大部分的有機(jī)物質(zhì)、沸點高及易濃縮等優(yōu)點，采用乙醚進(jìn)行萃取有助于發(fā)掘課題組前期未發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)。本研究在嫁接番茄根系分泌物的乙醚萃取組分中新鑒定出DP和BHT 2種之前在其他萃取劑組分未檢測到的物質(zhì)。DP是鄰苯二甲酸的衍生物，BHT是酚酸類物質(zhì)，通過驗證，DP和BHT是嫁接番茄根系分泌物中提高番茄青枯病抗性的主要活性成分。

根系分泌物中的特異活性物質(zhì)可通過直接影響病原菌的生長繁殖來影響植株的抗病性。研究發(fā)現(xiàn)，在青枯菌侵染條件下，添加有機(jī)酸和水楊酸后能顯著降低番茄的發(fā)病率和植株莖內(nèi)的青枯菌數(shù)量（范雪瀅，2016）。施加BHT和棕櫚酸后可顯著降低感病番茄的根結(jié)線蟲發(fā)病率和蟲卵的孵化率，提高2齡幼蟲的死亡率（Yang et al.，2016）。本研究中，DP和BHT灌根處理后的高感青枯病番茄在接種青枯菌后，發(fā)病率及病情指數(shù)均下降，效果最好的是2.0 mmol/L DP處理，但在研究中發(fā)現(xiàn)，2.0 mmol/L的DP和BHT灌根處理會使部分植株生長發(fā)育受到影響，嚴(yán)重的會發(fā)生葉片發(fā)黃脫落現(xiàn)象。段曦等（2017）在對辣椒的研究中也發(fā)現(xiàn)，高濃度的二苯并呋喃和鄰苯二甲酸二異辛酯處理會使辣椒葉片發(fā)生失綠現(xiàn)象，并推測可能與高濃度的根系分泌物活性物質(zhì)澆灌傷害了植株根系有關(guān)。因此，出于生產(chǎn)實踐應(yīng)用考慮，在本研究的后續(xù)試驗中2種物質(zhì)的最高濃度設(shè)為1.0 mmol/L。

本研究結(jié)果顯示，DP和BHT 2種活性物質(zhì)混合處理比單一物質(zhì)處理的防病效果好，其中1.0 mmol/L相同濃度混合處理的發(fā)病率和病情指數(shù)分別降至46.7%和42.5。董月（2014）對番茄青枯病拮抗菌的研究中也發(fā)現(xiàn)，提高根系的碳源多樣性能有效提高解淀粉芽孢桿菌T-5對青枯菌的抑制作用，單一碳源條件下，青枯菌平均抑制率僅為36.2%，而18種碳源復(fù)合條件下青枯菌抑制率達(dá)89.2%。

土壤微生物生物量是土壤環(huán)境變化的指示因子（馬志良等， 2019），嫁接番茄對青枯病抗性的增強(qiáng)與根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量的下降有關(guān)（趙文宗，2019）。根系分泌物可改變土壤微生物群落，據(jù)報道，小麥根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)可抑制細(xì)菌的活性（Wu et al.，2001）;番茄根系分泌物中的脂類物質(zhì)可降低根際可培養(yǎng)放線菌數(shù)量（Yang et al.， 2016）;煙草根系分泌物中的酚酸類物質(zhì)可降低根際可培養(yǎng)真菌數(shù)量（劉艷霞等，2019）。本研究結(jié)果顯示，施加BHT和DP能降低番茄植株體內(nèi)及根際的青枯菌數(shù)量，降低土壤微生物總量;1.0 mmol/L的2種活性物質(zhì)處理均可顯著抑制根際細(xì)菌生長，降低根際及植株體內(nèi)青枯菌數(shù)量;高濃度的BHT可抑制根際真菌生長;所有濃度的DP均可在發(fā)病初期顯著抑制根際放線菌的生長。說明2種根系分泌物質(zhì)通過影響根際微生物提高番茄植株對青枯病的抗性。值得注意的是，土壤微生物稀釋平板法作為對根際土壤微生物研究的基本方法，并不能完全反映土壤微生物的實際情況，且易受外界因素干擾，出現(xiàn)誤差，僅能作為根際土壤微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量的初步參考，下一步擬結(jié)合高通量測序技術(shù)進(jìn)一步探討根系分泌活性物質(zhì)對根際微生物的影響。同時，植物根系分泌物的組分復(fù)雜，其中是否還存在更多能提高番茄對青枯病抗性的活性物質(zhì)還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

采用GC-MS技術(shù)鑒定分析嫁接番茄的根系分泌物成分，篩選出鄰苯二甲酸二甲酯和2，6-二叔丁基對甲苯酚2種活性物質(zhì)，其可通過改善根際微環(huán)境、降低植株體內(nèi)和根際的青枯菌數(shù)量而提高番茄對青枯病的抗性。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）