副溶血弧菌對羅氏沼蝦肝胰腺和鰓組織中呼吸相關(guān)酶活性及抗氧化酶基因表達的影響

孔嘉明 戴習(xí)林 黎蘭詩 梁震宇

摘要：【目的】探討副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）對羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）肝胰腺和鰓組織中呼吸相關(guān)酶活性和抗氧化酶基因的影響，以期為羅氏沼蝦免疫機理研究和病害防治提供參考依據(jù)?！痉椒ā窟x取規(guī)格整齊、健康的羅氏沼蝦，分別注射PBS溶液（對照組）和副溶血弧菌（試驗組），在第1、3、6、12、24、48、72和96 h統(tǒng)計累計存活率，并取肝胰腺和鰓組織進行呼吸相關(guān)酶活性及抗氧化酶相關(guān)基因表達測定?！窘Y(jié)果】羅氏沼蝦感染副溶血弧菌后，隨著時間的推移，其累計存活率逐漸下降，在96 h累計存活率為72%。感染副溶血弧菌后，其肝胰腺中的ATP合酶、細(xì)胞色素C氧化酶和NADH脫氫酶活性隨時間延長均呈先降低后上升最后趨于對照組水平的變化趨勢，且在6～24 h 3種酶活性均顯著低于對照組（P<0.05，下同），之后酶活性逐步上升;活性氧（ROS）含量則呈先上升后下降的變化趨勢，且在6～48 h顯著高于對照組;超氧化物歧化酶（SOD）基因、過氧化氫酶（CAT）基因及谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）基因相對表達量呈先升高后降低再升高的變化趨勢。在鰓組織中，ATP合酶、細(xì)胞色素C氧化酶和NADH脫氫酶的活性隨著感染時間的延長呈先降低后上升至趨于對照組水平，在6～72 h 3種酶活性不同時間段表現(xiàn)出顯著下降趨勢;ROS含量則呈先上升后下降的變化趨勢;SOD、CAT和GPX基因相對表達量呈先升高后降低再升高的變化趨勢，且均在感染6 h顯著上調(diào)至最大值，其中GPX基因相對表達量在12～48 h顯著下調(diào)低于對照組，并在72 h逐漸上調(diào)。【結(jié)論】副溶血弧菌感染羅氏沼蝦后對肝胰腺和鰓組織中的呼吸相關(guān)酶及抗氧化酶基因產(chǎn)生顯著影響，ROS水平呈上升趨勢。雖然羅氏沼蝦能通過自我調(diào)節(jié)呼吸相關(guān)酶和抗氧化酶基因促使機體抵御病原體入侵，但超過機體自我調(diào)節(jié)的限度時會對機體造成損傷。

關(guān)鍵詞： 羅氏沼蝦;副溶血弧菌;呼吸相關(guān)酶;抗氧化酶基因

中圖分類號： S945.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3294-09

Effects of Vibrio parahaemolyticus on activities of respiratory-related enzymes and gene expression of antioxidant enzymes in hepatopancreas and gill of Macrobrachium rosenbergii

KONG Jia-ming1，2， DAI Xi-lin1，2，3，4*， LI Lan-shi2，4， LIANG Zhen-yu2，4

（1Shanghai Ocean University， National Experimental Teaching Demonstration Center of Fisheries Science， Shanghai 201306， China; 2Shanghai Shencao Special Aquatic Development Company， Shanghai? 201516， China; 3Shanghai Ocean University， Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources， Shanghai 201306， China; 4Shanghai Ocean University， Aquatic Animal Genetic Breeding Center

Shanghai Collaborative Innovation Center， Shanghai? 201306， China）

Abstract：【Objective】To investigate the effects of Vibrio parahaemolyticus on the activities of respiratory-related enzymes and antioxidant enzyme genes in hepatopancreas and gill of Macrobrachium rosenbergii， in order to provide referen-ce for the immune mechanism research and disease control of M. rosenbergii. 【Method】Regular and healthy M. rosenbergii was selected and injected with PBS solution（control group） and V. parahaemolyticus（experimental group） respectively. The cumulative survival rate was counted at the 1， 3， 6， 12， 24， 48， 72 and 96 h， and the activities of respiratory related enzymes and the expression of antioxidant enzyme related genes were measured in hepatopancreas and gill tissues.【Result】After being infected with V. parahaemolyticus， the cumulative survival rate of M. rosenbergii gradually decreased with the passage of time， and the cumulative survival rate was 72% at 96 h. After infection with V. parahaemolyticus， compared with the control group， the activities of ATP synthase， cytochrome C oxidase and NADH dehydrogenase in the hepatopancreas of M. rosenbergii in the experimental group decreased at first and then increased and finally tended to be the level of the control group. At 6 to 24 h， the activities of the three enzymes were significantly lower than those in the control group（P<0.05，the same below）， and then gradually increased. The reactive oxygen species （ROS） content increased at first and then decreased， and? was significantly higher than that in control group at 6-48 h. Superoxide dismutase （SOD） gene， catalase （CAT） gene and glutathione peroxidase （GPX） gene increased at first，then decreased and then increased. In the gill tissue of M. rosenbergii in the experimental group， the activities of ATP synthase， cytochrome C oxidase and NADH dehydrogenase decreased at first and then increased to the level of the control group， and the activities of the three enzymes decreased significantly at 6-72 h. The activity of reactive oxygen species increased at first and then decreased. The relative expression of SOD gene， CAT gene and GPX gene increased first， then decreased and finally increased， and both of them significantly increased to the maximum at 6 h after infection， in which the relative expression of GPX gene significantly decreased from 12-48 h to lower than that of the control group， and gradually increased at 72 h. 【Conclusion】V. parahaemolyticus infection of M. rosenbergii has significant effect on antioxidant enzyme genes and respiratory-related enzymes in hepatopancreas and gill tissues， the level of ROS increases. Although M. rosenbergii can resist pathogen invasion by self-regulating antioxidant enzyme genes and respiratory-related enzymes， it will cause damage to the body when it exceeds the limit of self-regulation.

Key words： Macrobrachium rosenbergii; Vibrio parahaemolyticus; respiratory related enzymes; antioxidant enzyme gene

Foundation item： Shanghai Shrimp Industry Technology System Construction Project（HNKCZ〔2016〕5）

0 引言

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）是一種重要的經(jīng)濟甲殼類動物，原產(chǎn)于東南亞，其肉質(zhì)鮮嫩，個體大，生長速度快，是我國重要的淡水養(yǎng)殖蝦類。隨著羅氏沼蝦集約化養(yǎng)殖發(fā)展和環(huán)境惡化，各種疾病頻繁暴發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。弧菌屬如創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、鰻弧菌（V. anguillarum）、哈維氏弧菌（V. harveyi）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）等容易引發(fā)養(yǎng)殖水生動物的疾病（蔣葛等，2019）。當(dāng)養(yǎng)殖水環(huán)境惡化，會引起蝦類免疫機能失衡和組織出現(xiàn)損傷，從而降低蝦類對入侵病原的防御能力（趙偉等，2017）。無脊椎動物缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，防御機制主要依靠先天免疫反應(yīng)來保護自身免受病原體的侵襲。因此，深入了解蝦類的先天免疫能力和免疫防御機制，有利于蝦類養(yǎng)殖業(yè)的健康管理和疾病控制發(fā)展。過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（·O2-）和羥自由基（·OH）等活性氧（ROS）被認(rèn)為與癌癥、衰老和各種炎癥性疾病有關(guān)（曹玲芳等，2013），可有效殺死病原微生物，并在免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用（劉曉華，2010）。但過量的ROS會造成機體損傷，導(dǎo)致各種疾病。可見，研究抗氧化系統(tǒng)，對無脊椎動物生長發(fā)育具有重要意義。【前人研究進展】病毒性和細(xì)菌性疾病對水產(chǎn)動物的影響研究非常廣泛。研究表明肝胰腺是甲殼動物產(chǎn)生ROS的代謝中心，鰓是呼吸器官，血淋巴中的病原體主要由鰓吸收，比其他器官更能引起生理功能的改變或?qū)ζ鞴俚膿p傷（Duan et al.，2015）。目前關(guān)于水生動物呼吸鏈的研究已有報道，對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）在凡納濱對蝦細(xì)胞中的快速復(fù)制導(dǎo)致宿主腺苷三磷酸（ATP）快速消耗，影響宿主細(xì)胞其他能量依賴的生物學(xué)功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡（Liang et al.，2015）;Ma等（2020）通過核磁共振的代謝組學(xué)方法研究哈維氏弧菌感染凡納濱對蝦，發(fā)現(xiàn)蝦體內(nèi)大多與能量相關(guān)的代謝途徑的氨基酸呈下降趨勢。此外，對于生化和理化因子的刺激，低溫干露、不同濃度的硫化物會導(dǎo)致蝦類肝胰腺中細(xì)胞色素C氧化酶降低，其蛋白質(zhì)合成和能量代謝功能改變（連春盎，2016;Li et al.，2017）。陳萍等（2009）研究表明溶藻弧菌感染梭子蟹（Portunus trituberculatus），會造成機體消除自由基的抗氧化酶活性降低。Duan等（2013）、段亞飛等（2015）研究表明鰻弧菌感染脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda），對抗氧化酶及基因產(chǎn)生影響，而ROS過量產(chǎn)生加劇膜脂過氧化，會導(dǎo)致細(xì)胞損傷和氧化損傷。在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）（Liu et al.，2007）、中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）（Zhang et al.，2008）和克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）（Xia et al.，2013）的相關(guān)研究中均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能誘導(dǎo)抗氧化酶基因上調(diào)。【本研究切入點】羅氏沼蝦作為水產(chǎn)經(jīng)濟動物，在養(yǎng)殖過程中，細(xì)菌性疾病對其生長發(fā)育及產(chǎn)量影響嚴(yán)重，目前有關(guān)細(xì)菌對羅氏沼蝦的影響研究主要集中在免疫信號通路（Toll、IMD、JAK/STAT信號通路）、抗菌肽、藥物防治和疫苗研發(fā)等方面（史晏如，2016;辛芳，2016），而針對細(xì)菌侵染羅氏沼蝦對其呼吸鏈相關(guān)酶的影響及與抗氧化酶基因的關(guān)系研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對健康羅氏沼蝦進行副溶血弧菌注射感染，從酶活性和基因表達水平探究感染后羅氏沼蝦的肝胰腺和鰓組織中呼吸相關(guān)酶、抗氧化酶基因及ROS隨時間變化的規(guī)律，為羅氏沼蝦免疫機理研究和病害防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

羅氏沼蝦由上海申漕特種水產(chǎn)開發(fā)公司提供，隨機挑選健康、活力強、規(guī)格均一的羅氏沼蝦150尾，初始體重為15.64±2.15 g，將其暫養(yǎng)在水泥池中1周后進行試驗。副溶血弧菌由上海海洋大學(xué)病原庫提供。TRNzol Univesal Reagent和FastKing RT Kit購自TIANGEN公司，Talent QPCR PreMIX購自SYBR Green TIANGEN公司，ATP合酶（ATPase）、細(xì)胞色素C氧化酶（CCO）、NADH脫氫酶（ND）和ROS試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司，線粒體蛋白提取試劑盒和蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1. 2 試驗方法

采取注射攻毒的方式，為了使羅氏沼蝦既有免疫反應(yīng)且死亡數(shù)量較小，經(jīng)過預(yù)試驗，確定本試驗選取5×107 CFU/mL為最佳注射濃度。試驗在200 L水族箱中進行。將試驗用蝦隨機分為對照組和試驗組，每組設(shè)3個平行，每個水族箱放25尾。試驗組在每尾蝦的第二腹節(jié)基部注射100 μL副溶血弧菌菌液（5×107 CFU/mL），對照組注射等量的PBS溶液。試驗期間水溫平均（26±1）℃，每天早晚各投喂一次配合飼料，日換水1/3，并連續(xù)充氣。注射后分別于1、3、6、12、24、48、72和96 h，觀察其攝食情況、統(tǒng)計存活率，并在每個時間點取2尾蝦的肝胰腺和鰓組織于液氮中冷凍保存，以用于酶活性和基因表達的測定。

1. 3 抗氧化酶基因表達分析

RNA提?。簠⒄誘RNzol Univesal Reagent說明書提取-80 ℃羅氏沼蝦肝胰腺和鰓組織的總RNA。提取的總RNA用Nanodrop-lite測定OD260和OD280值，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。RNA反轉(zhuǎn)錄：按照FastKing RT Kit說明書進行操作。在GenBank中查得羅氏沼蝦過氧化氫酶（CAT，HQ668089.1）、超氧化物歧化酶（SOD，DQ121374.1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX，F(xiàn)J670566.1）及18S（GQ131934.1）序列，設(shè)計引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實時熒光定量PCR（RT-PCR）：以羅氏沼蝦18S為內(nèi)參基因，參照Talent QPCR PreMIX說明書進行基因表達量的測定，以2-△△Ct的方法進行計算。

1. 4 呼吸相關(guān)酶活性測定

取組織稱量后放入玻璃勻漿器，按質(zhì)量體積比1∶9加0.1% PBS緩沖液于冰水混合物中，勻漿制備成10%組織勻漿液，于4 ℃冷凍離心機3000 r/min低速離心15 min，取上清液制備粗酶液，然后按各種酶試劑盒說明書進行操作，并用科華酶標(biāo)儀檢測讀數(shù)。

1. 5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），以Excel 2016制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 副溶血弧菌對羅氏沼蝦存活率的影響

由圖1可知，對照組的羅氏沼蝦累計存活率保持在100%，而感染副溶血弧菌的羅氏沼蝦隨著時間的推移，累計存活率逐漸下降，在6 h出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，24 h的累計存活率為84%，感染48 h后羅氏沼蝦活力減弱、反應(yīng)變慢，攝食量變少，在96 h累計存活率為72%。試驗中觀察到，對照組的羅氏沼蝦攝食正常，未出現(xiàn)死亡;而試驗組中瀕臨死亡的羅氏沼蝦附肢和尾扇變紅，肌肉輕微泛白，甲殼上出現(xiàn)損傷并變黑。

2. 2 副溶血弧菌對羅氏沼蝦呼吸相關(guān)酶活性的影響

2. 2. 1 副溶血弧菌對肝胰腺中呼吸相關(guān)酶活性的影響 由圖2可知，與對照組相比，感染副溶血弧菌的羅氏沼蝦肝胰腺中ATP合酶、細(xì)胞色素C氧化酶和NADH脫氫酶活性總體呈先降低后升高的變化趨勢，3種酶活性在6～24 h均顯著低于對照組（P<0.05，下同）。ATP合酶活性在48 h顯著上調(diào)，隨后趨于對照組水平（圖2-A）;細(xì)胞色素C氧化酶活性在第6 h下調(diào)幅度最大，但在72和96 h顯著高于對照組水平（圖2-B）;NADH脫氫酶在第12 h下調(diào)幅度最大，至72 h顯著上調(diào)，隨后趨于對照組水平（圖2-C）。試驗組ROS含量呈先上升后下降的變化趨勢，在第6 h顯著高于對照組并持續(xù)升高，至72 h降低至對照組水平（圖2-D）。

2. 2. 2 副溶血弧菌對鰓組織中呼吸相關(guān)酶活性的影響 由圖3可知，與對照組相比，感染副溶血弧菌的羅氏沼蝦鰓組織中ATP合酶、細(xì)胞色素C氧化酶和NADH脫氫酶活性總體呈先降低后上升并趨于對照組水平的變化趨勢。3種酶活性均在第3 h顯著上調(diào);ATP合酶活性在12～72 h顯著降低，在96 h趨于對照組水平（圖3-A）;細(xì)胞色素C氧化酶活性在6～48 h顯著降低，在72 h趨于對照組水平（圖3-B）;NADH脫氫酶活性在6～72 h顯著降低，在96 h趨于對照組水平（圖3-C）。而試驗組ROS含量（圖3-D）與肝胰腺中ROS含量變化基本一致。

2. 3 副溶血弧菌對羅氏沼蝦抗氧化酶基因的影響

2. 3. 1 副溶血弧菌對肝胰腺抗氧化酶基因的影響 羅氏沼蝦在感染副溶血弧菌后，對肝胰腺的抗氧化酶基因表達產(chǎn)生不同程度的影響（圖4）。與對照組相比，試驗組羅氏沼蝦的肝胰腺中SOD、CAT和GPX基因相對表達量呈升高—降低—升高的變化趨勢。SOD和CAT基因相對表達量均在3 h顯著下調(diào)，6 h顯著上調(diào)，6 h后下調(diào)，并在72 h趨于對照組水平，但CAT基因在96 h又顯著上調(diào)（圖4-A和圖4-B）;GPX基因相對表達量在感染前期（1～3 h）顯著上調(diào)，隨后顯著下調(diào)，至24 h趨于對照組水平，感染后期72 h顯著上調(diào)，且上調(diào)幅度最大（圖4-C）。

2. 3. 2 副溶血弧菌對鰓組織抗氧化酶基因的影響 由圖5可知，與對照組相比，試驗組羅氏沼蝦的鰓組織中SOD、CAT和GPX基因相對表達量均呈升高—降低—升高的變化趨勢，與對肝胰腺的影響變化一致。3種基因相對表達量均在感染6 h顯著上調(diào)至最大值;SOD基因相對表達量在24～48 h下調(diào)，且顯著低于對照組，但在96 h顯著上調(diào)（圖5-A）;CAT基因相對表達量在24 h下調(diào)，48 h為最小值，隨后趨于對照組水平（圖5-B）;GPX基因相對表達量在12～48 h顯著低于對照組，但在72 h顯著上調(diào)，并于96 h趨于對照組水平（圖5-C）。

3 討論

弧菌是蝦類養(yǎng)殖業(yè)中危害嚴(yán)重的病原之一，可導(dǎo)致蝦類機體生理功能紊亂，造成嚴(yán)重死亡和經(jīng)濟損失。而溶藻弧菌和副溶血弧菌在弧菌中表現(xiàn)出溶血性，且弧菌對氨芐青霉素、紅霉素和鏈霉素均具有多重耐藥性，被歸為羅氏沼蝦中毒力最強的弧菌。本試驗開展副溶血弧菌對羅氏沼蝦肝胰腺和鰓組織的損傷機制研究，可為羅氏沼蝦的病害防治提供參考依據(jù)，具有重要意義。

呼吸暴發(fā)是一種快速、短暫、產(chǎn)生大量ROS的過程，是甲殼類動物抵御細(xì)菌、真菌和病毒等入侵微生物的重要防御策略之一（Liu et al.，2007）。盡管ROS在宿主防御中起著重要保護作用，但其過量和殘留會導(dǎo)致機體損傷。因此，無脊椎動物均有保護性機制來平衡ROS的產(chǎn)生和避免氧化應(yīng)激，即抗氧化系統(tǒng)（霍利杰，2019）?？寡趸到y(tǒng)能防止ROS的有害作用，在保護機體免受氧化應(yīng)激、預(yù)防或修復(fù)氧化損傷方面發(fā)揮作用。凡納濱對蝦的ROS水平在銅暴露后顯著增加，且與血細(xì)胞凋亡存在相關(guān)性，誘導(dǎo)CAT和SOD的相對表達水平下調(diào)（Guo et al.，2017）。 中國明對蝦感染副溶血弧菌后，其肝胰腺中ROS在6 h顯著增加，12 h達最大值，鰓中ROS在3 h增加，48 h趨于對照組但仍高于對照組（Ren et al.，2009）。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，副溶血弧菌感染期間會提高組織中的ROS水平以殺死病原菌，本研究羅氏沼蝦肝胰腺和鰓組織中的ROS含量均呈先升高后降低的變化趨勢，可能由于細(xì)菌在體內(nèi)不斷繁殖，導(dǎo)致ROS水平升高，ROS的變化會引起抗氧化酶基因水平的變化，以維持機體平衡，當(dāng)ROS含量超出抗氧化系統(tǒng)的閾值時，機體會出現(xiàn)氧化損傷甚至死亡。但本研究中，副溶血弧菌感染羅氏沼蝦是否造成蝦組織細(xì)胞凋亡或壞死，還需通過組織切片或檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因變化來驗證。

線粒體作為細(xì)胞儲存和提供能量的場所，具有氧化磷酸化、傳遞電子、能量代謝和抗ROS等重要生理作用，是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的源頭，也是細(xì)胞凋亡的主要位點（方允中等，2003）。線粒體是體內(nèi)氧自由基的重要來源之一，生物體內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)保持動態(tài)平衡，若過量的超氧負(fù)離子O2-及其歧化產(chǎn)物H2O2（ROS主要形式）產(chǎn)生，會加重線粒體DNA、酶和膜脂質(zhì)損傷，同時加重細(xì)胞功能降低或細(xì)胞死亡。本研究中感染副溶血弧菌的羅氏沼蝦，其肝胰腺中NADH脫氫酶、ATP合酶和細(xì)胞色素C氧化酶的活性較鰓組織中的活性高;ROS含量變化與呼吸鏈酶活性呈負(fù)相關(guān)，與李杰等（2017）的研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)低表達NADH脫氫酶的乳鼠心肌細(xì)胞，線粒體電子傳遞鏈上泄露了比正常表達NADH脫氫酶更多的ROS，而ROS含量較高會啟動線粒體介導(dǎo)的凋亡通路。羅氏沼蝦感染副溶血弧菌后，隨著時間的延長，副溶血弧菌在體內(nèi)擴散，肝胰腺中的NADH脫氫酶、ATP合酶和細(xì)胞色素C氧化酶在6～24 h顯著降低，推測一方面可能是由于針刺或高濃度的細(xì)菌進入蝦體內(nèi)，導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生氧化應(yīng)激;另一方面可能是細(xì)菌在蝦體內(nèi)進行大量繁殖，導(dǎo)致過量的ROS產(chǎn)生從而抑制了呼吸鏈酶活性。48 h后，呼吸鏈酶活性逐漸上升，可能是抗氧化系統(tǒng)對過量ROS逐漸清除，先天免疫信號通路、中性粒細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬與清除。Zhao等（2014）研究發(fā)現(xiàn)鯽魚（Carassius auratus）暴露于微囊藻毒素48 h，肝臟中線粒體編碼基因（COX1、COX2、COX3、ATP6）的表達和5種線粒體復(fù)合物酶活性均顯著降低，且呈時間依賴性。本研究中，羅氏沼蝦鰓組織中NADH脫氫酶、ATP合酶和細(xì)胞色素C氧化酶活性在3 h前升高，可能是細(xì)菌通過血液運輸?shù)仅w，低濃度的細(xì)菌會刺激呼吸鏈酶活性升高，后期由于細(xì)菌繁殖引起ROS過量導(dǎo)致呼吸鏈酶活降低。上述結(jié)果與中國對蝦的研究報道（Mohankumar and Ramasamy，2006）一致，其推測是由于蝦體內(nèi)病毒載量過多，引起自由基過多，從而導(dǎo)致ATP產(chǎn)量降低;也可能是感染后攝食減少，導(dǎo)致TCA循環(huán)中葡萄糖氧化的減少。

SOD、CAT和GPX之間具有協(xié)同作用（時少坤等，2013;梁俊平等，2020）。O2-是呼吸暴發(fā)釋放的第一個產(chǎn)物，可以被SOD轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2可通過細(xì)胞膜擴散到細(xì)胞質(zhì)中，再通過CAT和GPX將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2。ROS的增加在蝦類感染細(xì)菌的早期反應(yīng)中起重要作用。本研究中，羅氏沼蝦在注射副溶血弧菌后，其鰓組織和肝胰腺中SOD、CAT及GPX基因轉(zhuǎn)錄水平均升高，說明ROS誘導(dǎo)抗氧化酶基因來提高機體抗氧化防御能力及時清除過多的ROS，以維持代謝平衡，與Ji等（2011）研究凡納濱對蝦受副溶血弧菌和白斑病毒感染后的報道結(jié)果一致。Tian等（2011）對凡納濱對蝦注射WSSV后的相關(guān)研究表明SOD基因?qū)SSV有誘導(dǎo)和應(yīng)答作用。本研究羅氏沼蝦感染副溶血弧菌后，其肝胰腺中SOD基因相對表達量在6 h顯著上調(diào)，隨后顯著下調(diào);鰓組織中在6 h顯著上調(diào)，后顯著下調(diào)，最后趨于對照組水平，與斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）感染副溶血弧菌后肝胰腺中SOD基因相對表達量在6和12 h顯著上調(diào)的結(jié)果基本一致（Bu et al.，2017）。上述結(jié)果表明機體產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)SOD表達，通過提高抗氧化酶活性來保護機體。隨著病原體在宿主體內(nèi)不斷繁殖，更多的病原體造成機體產(chǎn)生更高的局部ROS，可能超出抗氧化酶系統(tǒng)的閾值，導(dǎo)致SOD基因受到抑制。

CAT不僅參與細(xì)胞內(nèi)ROS的代謝過程，維持細(xì)胞氧化還原平衡，還能增強吞噬細(xì)胞的防御能力及免疫功能，有效抑制脂質(zhì)的過氧化作用，保護機體免受損傷（陳曉敏，2017）。鰻弧菌感染脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda），其鰓組織中CAT基因相對表達量在12 h后始終處于較高水平，推測可能是H2O2含量顯著增加誘導(dǎo)CAT基因的表達，產(chǎn)生較多的CAT用于分解過多的H2O2（Duan et al.，2013）。而本研究中，羅氏沼蝦的肝胰腺和鰓組織中CAT基因相對表達量在感染前期顯著上調(diào)，在12 h后轉(zhuǎn)錄水平有所下調(diào)，與Ji等（2011）對凡納濱對蝦注射副溶血弧菌后肝胰腺中CAT表達的研究結(jié)果一致，推測是弧菌后期破壞了對蝦的免疫應(yīng)答。WSSV感染中國對蝦后，肝胰腺CAT基因表達水平在0～14 h降至較低水平，在23 h顯著上調(diào)，之后下降至正常水平（Zhang et al.，2008）。這與副溶血弧菌感染羅氏沼蝦不同，可能不同的感染劑量和感染方法導(dǎo)致應(yīng)答的差異。在注射后早期，針刺和細(xì)菌刺激誘導(dǎo)了一定的免疫反應(yīng)，進而影響羅氏沼蝦的正常生理功能，CAT表達上調(diào);隨著細(xì)菌不斷繁殖，在注射后較晚時間刺激作用增強，使機體局部產(chǎn)生過量ROS，從而抑制CAT的表達。

GPX和硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）對H2O2親和力高于CAT，即GPX和TPX在H2O2濃度很低的情況下也能有效地清除H2O2，而CAT不能（Kang et al.，2005）。本研究中，羅氏沼蝦感染副溶血弧菌前期，肝胰腺和鰓組織中的GPX基因相對表達量顯著上調(diào)，中期受到抑制，后期又出現(xiàn)顯著上調(diào)，與Xia等（2013）對克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV和金黃色葡萄球菌后GPX基因的表達趨勢、程超等（2020）對嗜水氣單胞菌刺激中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明，過量的ROS可能會導(dǎo)致SOD、CAT和GPX基因在一定時間段會受到短暫抑制，但在后期均表現(xiàn)出上調(diào)趨勢，ROS后期降低也說明了抗氧化酶基因?qū)OS的清除作用。但蝦類的免疫系統(tǒng)較復(fù)雜，同一種抗氧化酶基因在不同感染研究中表現(xiàn)出的不同變化趨勢，可能與病原種類、感染劑量、組織的功能與定位、蝦的種類及規(guī)格等因素有關(guān)（羅詞興等，2014）。此外，造成ROS含量降低的原因不僅是抗氧化酶系統(tǒng)的作用，具體還需更深入的研究。

4 結(jié)論

副溶血弧菌感染羅氏沼蝦后對肝胰腺和鰓組織中的呼吸相關(guān)酶及抗氧化酶基因產(chǎn)生顯著影響，ROS水平呈上升趨勢。雖然羅氏沼蝦能通過自我調(diào)節(jié)呼吸相關(guān)酶和抗氧化酶基因促使機體抵御病原體入侵，但超過機體自我調(diào)節(jié)的限度時會對機體造成損傷。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）