心臟移植術(shù)后血液免疫監(jiān)測(cè)研究進(jìn)展*

柴軍武 王 凱 孔祥榮

天津市第一中心醫(yī)院心血管外科 300110

盡管機(jī)械循環(huán)輔助不斷完善與發(fā)展，心臟移植仍然是終末期心臟病患者的長(zhǎng)期治療首要選擇，心臟移植術(shù)后患者可獲得良好的生活質(zhì)量。心內(nèi)膜心肌活檢(EMB)是心臟移植術(shù)后排斥反應(yīng)監(jiān)測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于EMB檢測(cè)的有創(chuàng)性，極大地限制了移植術(shù)后免疫抑制程度的監(jiān)測(cè)，這樣就造成無法科學(xué)應(yīng)用免疫抑制藥物，進(jìn)而影響到排斥反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，而過強(qiáng)的免疫抑制，又會(huì)造成感染的發(fā)生。經(jīng)皮心肌內(nèi)膜活檢(EMB)用于評(píng)估心臟移植后排斥反應(yīng)已經(jīng)有45年的歷史，其最初局限于急性細(xì)胞排斥反應(yīng)(Acute cellular rejection,ACR)的評(píng)估，但近年來，對(duì)供體特異性抗體導(dǎo)致急性抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(Acute antibody-mediated rejection,AMR)的作用有了越來越多的認(rèn)識(shí)，AMR患者可能比ACR預(yù)后更差[1], 近年來，EMB作為排斥反應(yīng)的診斷金標(biāo)準(zhǔn)逐步形成共識(shí)，然而，EMB仍然有很大的局限性。其侵襲性與手術(shù)可能的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，包括三尖瓣損傷、心肌穿孔和冠狀動(dòng)脈瘺的發(fā)生。即使經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家也可能由于取樣誤差，無法評(píng)估更深的心肌組織，在同一患者不同標(biāo)本之間在組織學(xué)解釋上也缺乏一致意見，使得該技術(shù)的敏感性也有限。然而，活檢仍然是監(jiān)測(cè)和診斷急性排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)?；虮磉_(dá)譜(GEP)的引入可減少了許多患者需要進(jìn)行活組織檢查的次數(shù)，而目前大多數(shù)中心仍將EMB作為最初6～12個(gè)月監(jiān)測(cè)的主要方法[2]。目前主要血液系統(tǒng)檢測(cè)有以下幾個(gè)方面。

1 基因表達(dá)譜

最近，有研究將分子技術(shù)用于評(píng)估活檢心肌內(nèi)的基因表達(dá)譜來提高診斷率。目前已開發(fā)了一種基于微陣列的系統(tǒng)來評(píng)估EMB標(biāo)本(The Molecular Microscope)。該系統(tǒng)確定了與AMR相關(guān)的不同轉(zhuǎn)錄本，包括自然殺傷細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本、巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本、內(nèi)皮激活轉(zhuǎn)錄本以及與國(guó)際心肺移植學(xué)會(huì)(ISHLT)病理抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)分級(jí)密切相關(guān)的干擾素轉(zhuǎn)錄本。這項(xiàng)技術(shù)提高了從單個(gè)活檢組織進(jìn)行排斥診斷的可能性，開啟了自動(dòng)化的可能性，并提供了定量結(jié)果。雖然這些進(jìn)展可提高EMB診斷率，但非侵入性的基于血液的檢測(cè)來評(píng)估移植排斥反應(yīng)可能降低成本和并發(fā)癥，并允許更頻繁地檢測(cè)來評(píng)估抗排斥治療的反應(yīng)[3]。

2 供體特異性抗體

移植時(shí)供體特異性抗體(DSA)的存在和移植后新生DSA的發(fā)展都與移植后不良反應(yīng)有關(guān)，包括排斥反應(yīng)、移植心臟血管病變和移植物失功。即使移植后受者的近1/3存在DSA，但DSA的存在并不一定預(yù)測(cè)AMR的發(fā)展。目前ISHLT指南建議移植后1、3、6和12個(gè)月時(shí)常規(guī)監(jiān)測(cè)抗人白細(xì)胞抗原 DSA[4-5]。近年來，非HLADSA的研究越來越多，已發(fā)現(xiàn)與急性和慢性同種異體排斥反應(yīng)有關(guān)。檢測(cè)到的抗原包括主要組織相容性Ⅰ類相關(guān)基因A (MICA)、血管緊張素Ⅱ型1受體(ATIR)、內(nèi)皮素A型受體內(nèi)皮細(xì)胞抗原、波形蛋白(vimentin)、膠原-Ⅴ和非HLA IgM抗體[6]。有證據(jù)表明，抗內(nèi)皮抗體與AMR和移植心臟血管病變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。新生HLA DSA聯(lián)合AT1R抗體的發(fā)展可能對(duì)移植后心臟移植排斥反應(yīng)的發(fā)展有害[7]。目前，這些抗體在急性和慢性排斥反應(yīng)中的檢測(cè)仍在研究中。非HLA抗體在介導(dǎo)同種異體心臟損傷中的臨床意義和作用尚不明確。

3 組織損傷和心臟功能的標(biāo)記物

許多與微血管血栓形成相關(guān)的早期生物標(biāo)志物(微血管纖維蛋白沉積、血管組織纖溶酶原激活物的消耗、內(nèi)皮激活和血管抗凝血酶的丟失)以及血清心肌肌鈣蛋白的檢測(cè)和血清可溶性黏附分子水平的升高，都與后期移植心臟血管病變相關(guān)。在最近一篇評(píng)估心肌肌鈣蛋白檢測(cè)ACR的研究綜述中，高靈敏度的肌鈣蛋白檢測(cè)確定具有高靈敏度(82%～100%)和高陰性預(yù)測(cè)值(97%～100%)[8]。

在一項(xiàng)前瞻性生物標(biāo)志物研究中，評(píng)估與心肌細(xì)胞損傷(肌鈣蛋白)、心功能(鈉尿肽)、纖維化(Galectin-3和ST-2)和心腎功能(Cystatin-c)相關(guān)的生物標(biāo)志物在心臟移植后10d與1年的結(jié)果[9]相關(guān)。只有胱抑素C和高敏感性肌鈣蛋白T (hsTnT)可預(yù)測(cè)1年死亡率。此外，在心臟移植后1年左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)降低的患者中，這兩個(gè)與半乳糖蛋白酶-3相關(guān)的生物標(biāo)記物均升高。n末端b型利鈉肽(NT-proBNP)未顯示早期預(yù)后情況。在本研究中，沒有測(cè)量到的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)排斥反應(yīng)，但至少發(fā)生排斥反應(yīng)的患者心臟移植后12個(gè)月，hsTnT和NT-proBNP顯著升高。許多研究表明，成人和兒童心臟移植受者中鈉尿肽的絕對(duì)測(cè)量值和連續(xù)測(cè)量值的變化可以預(yù)測(cè)急性同種異體排斥反應(yīng)[9-10]。

4 基因測(cè)序

第一個(gè)臨床可用于評(píng)估心臟移植排斥反應(yīng)的無創(chuàng)血液檢測(cè)是利用基因測(cè)序(Gene expression profile GEP)。在對(duì)已知同種異體免疫途徑和白細(xì)胞微陣列的分析中，252個(gè)候選基因被確定為實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。在隨后的一項(xiàng)較小的單中心研究(EIMAGE)中，對(duì)60名患者在移植后(55d)早期隨機(jī)進(jìn)行GEP或觀察活檢[11]。在排斥反應(yīng)監(jiān)測(cè)方面，GEP與EMB再次具有可比性，并且沒有導(dǎo)致不良結(jié)果的增加。GEP也被證明有助于指導(dǎo)皮質(zhì)類固醇的停止，在這方面與EMB相似。使用GEP (AlloMap)已被納入ISHLT指南，用于心臟移植后患者的管理，并有助于減少用于監(jiān)測(cè)排異反應(yīng)的活體組織檢查的數(shù)量[12]。

關(guān)于GEP的使用，有一些重要的注意事項(xiàng)。這項(xiàng)測(cè)試還沒有在移植<55d的患者身上得到驗(yàn)證。如果患者每天服用> 20mg的強(qiáng)的松，則應(yīng)避免使用(因?yàn)橐恍┍粰z測(cè)的基因?qū)︻惞檀加蟹磻?yīng))。應(yīng)避免在治療排斥反應(yīng)后21d內(nèi)和輸血后30d內(nèi)進(jìn)行該試驗(yàn)。重要的是，GEP還沒有在抗生素耐藥性患者中進(jìn)行試驗(yàn)。因此，EMB仍然是移植后前3個(gè)月監(jiān)測(cè)的首選測(cè)試，通常在第1個(gè)月每周進(jìn)行1次，然后每2周進(jìn)行1次。

5 游離DNA

細(xì)胞更新的一個(gè)不可避免的結(jié)果就是DNA釋放到循環(huán)系統(tǒng)中。游離DNA (cfDNA)是從健康、炎癥或病變組織中細(xì)胞凋亡或壞死細(xì)胞中重新釋放的。循環(huán)cfDNA自70年前在人類血漿中發(fā)現(xiàn)以來，作為一種非侵入性的診斷生物標(biāo)志物，已成為一個(gè)有價(jià)值的研究領(lǐng)域。在移植中，對(duì)移植受者血液中供體來源cfDNA (dd-cfDNA)的檢測(cè)被認(rèn)為是ACR和AMR損傷的無創(chuàng)標(biāo)志物。單中心研究表明，心臟移植急性排斥反應(yīng)后可檢測(cè)到dd-cfDNA水平升高，且升高先于EMB的組織學(xué)排斥反應(yīng)[13-14]。

最初的方法是使用全基因組測(cè)序來檢測(cè)和量化cfDNA，但是分析的復(fù)雜性和成本最終限制了它作為臨床有用工具的應(yīng)用。一種更快速、更具成本效益的監(jiān)測(cè)策略是對(duì)dd-cfDNA進(jìn)行有針對(duì)性的定量，但這需要對(duì)移植供體進(jìn)行基因分型，這是不切實(shí)際的。利用下一代測(cè)序?qū)魏塑账岫鄳B(tài)性進(jìn)行靶向擴(kuò)增，最近已被證實(shí)可以在不需要供體或受體的情況下量化移植受者的dd-cfDNA，基因分型結(jié)果[15]。在一項(xiàng)多中心回顧性病例對(duì)照研究中，這項(xiàng)技術(shù)已被證明可以檢測(cè)心臟移植受者的ACR。在腎移植中，一項(xiàng)前瞻性的多中心試驗(yàn)證明了該技術(shù)在檢測(cè)急性排斥反應(yīng)中的有效性[16]。

6 T細(xì)胞免疫功能

移植受者的管理面臨的挑戰(zhàn)是平衡免疫抑制，一方面防止感染、惡性腫瘤和藥物毒性等并發(fā)癥，另一方面防止移植物急性或慢性排斥反應(yīng)。單獨(dú)的治療藥物監(jiān)測(cè)不足以評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)，其重要價(jià)值是預(yù)防藥物毒性。ImmuKnow試驗(yàn)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)免疫，并幫助識(shí)別有感染和排斥風(fēng)險(xiǎn)的患者。該實(shí)驗(yàn)在外周血中進(jìn)行，測(cè)量活化淋巴細(xì)胞中三磷酸腺苷酶的釋放，幫助預(yù)測(cè)免疫狀態(tài)。它在評(píng)估腎、胰腺和小腸等實(shí)體器官移植的感染和排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)方面有一定作用。使用ImmuKnow試驗(yàn)[17]對(duì)來自10個(gè)美國(guó)中心的500多個(gè)實(shí)體器官移植受者(心臟、腎臟、腎胰、肝臟和小腸)進(jìn)行了薈萃分析，從移植后不同時(shí)間的受者身上提取血樣，并與臨床過程進(jìn)行比較。在這項(xiàng)分析中，39例經(jīng)活檢證實(shí)為細(xì)胞排斥和66例確診發(fā)生感染。免疫應(yīng)答值為25ng/ml ATP的受體發(fā)生感染的可能性是免疫應(yīng)答較強(qiáng)的受體的12倍。同樣，免疫反應(yīng)為700ng/ml ATP的受體發(fā)生ACR的可能性是免疫反應(yīng)值較低的受體的30倍。在中等免疫反應(yīng)區(qū)，感染和排斥的比值曲線相交于280ng/ml ATP，這為實(shí)體器官接受者的免疫功能提供了一個(gè)免疫目標(biāo)。在一項(xiàng)對(duì)近300名心臟移植受者的單中心研究中，在移植后2周～10年間共進(jìn)行了864次免疫監(jiān)測(cè)分析。感染病例38例，排斥病例8例。感染期間的平均免疫監(jiān)測(cè)評(píng)分明顯低于穩(wěn)定狀態(tài)(187ng/ml ATP VS 280ng/ml ATP,P<0.001)[18]。在臨床上，該分析對(duì)確定活動(dòng)性感染期間免疫抑制的程度最有用，如果免疫監(jiān)測(cè)評(píng)分較低(特別是< 100ng/ml ATP)，則可指導(dǎo)減少免疫抑制。免疫抑制劑量受藥物不耐受限制的患者，ImmuKnow可提供免疫抑制療效的測(cè)定，而不限于治療性藥物監(jiān)測(cè)。如果在無癥狀患者中進(jìn)行該試驗(yàn)，由于感染風(fēng)險(xiǎn)高，如果ATP/ml得分< 100ng/ml ATP，則可提示免疫抑制的降低，如果得分升高(>700ng/ml ATP)，則可能需要考慮加強(qiáng)免疫抑制。

7 小結(jié)

有效的免疫抑制藥物的應(yīng)用促進(jìn)了心臟移植作為治療終末期心臟病的發(fā)展。然而，自移植手術(shù)開始以來，如何平衡免疫抑制以減少移植排斥反應(yīng)、藥物毒性、感染和惡性腫瘤一直是挑戰(zhàn)。心肌損傷和功能的生物標(biāo)志物可以提供更多的數(shù)據(jù)來幫助確定移植后的移植物功能。GEP用于臨床，減少了對(duì)一些心臟移植受者進(jìn)行活體組織檢查以監(jiān)測(cè)排斥反應(yīng)的必要性。DSA監(jiān)測(cè)有助于對(duì)存在AMR風(fēng)險(xiǎn)的患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，dd-cfDNA有助于在活檢發(fā)現(xiàn)組織學(xué)變化前識(shí)別ACR和AMR風(fēng)險(xiǎn)患者。ImmuKnow試驗(yàn)在成人心臟移植受者臨床中主要用于評(píng)估過度免疫抑制和感染風(fēng)險(xiǎn)?？傊S著分子技術(shù)的快速發(fā)展,移植術(shù)后監(jiān)測(cè)將逐步完善。