尼可地爾對缺血性心力衰竭大鼠心功能的保護(hù)作用及機(jī)制

邢曉娜, 劉利君, 何元軍

(四川省廣元市中心醫(yī)院 心臟血管中心, 四川 廣元, 628017)

尼可地爾是具有硝酸鹽性質(zhì)的ATP敏感性鉀離子通道開放劑，適用于各類型心絞痛[1], 能顯著降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險，可對心臟病患者的心臟起保護(hù)作用[2]。研究[3]認(rèn)為，尼可地爾可減少冠心病患者心臟重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展，降低缺血性心力衰竭患者的死亡率[4]。心室重構(gòu)是指各種損傷使心臟原來存在的物質(zhì)和心臟形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，是機(jī)體的一種適應(yīng)性反應(yīng)，也是病變修復(fù)和心室整體代償繼發(fā)的病理生理反應(yīng)過程[5]。但是，關(guān)于尼可地爾是否能抑制缺血性心力衰竭的左室重構(gòu)及其機(jī)制尚未明確。本研究探討尼可地爾對缺血性心力衰竭大鼠心功能和左室重構(gòu)的影響和機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

40只雄性SD大鼠，體質(zhì)量160～200 g, 購于中國食品藥品檢定研究院[(生產(chǎn)許可證號: SCXK(京)2019-0017)]。尼可地爾購于長春大政藥業(yè)科技有限公司(國藥準(zhǔn)字H22024008)。將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。① 空白對照組(Con組): 不進(jìn)行任何手術(shù)干預(yù)，僅給予等體積、等時間生理鹽水灌胃。② 尼可地爾組(NIC組): 麻醉滿意后，采用Johns法建立大鼠缺血性心力衰竭模型。麻醉大鼠后，打開胸腔，在無菌手術(shù)條件下分離心包，然后抬起左耳廓，心臟被擠出。在大約1/3的下端結(jié)扎左冠狀動脈前降支。從尾部記錄每只大鼠的收縮壓、舒張壓和心率，對每個參數(shù)進(jìn)行3次測量。術(shù)后3 d至8周末，給予尼可地爾3 mg/kg·d灌胃。③ 生理鹽水組(NS組): 手術(shù)方式同NIC組，但給予等體積、等時間生理鹽水灌胃。④ 假手術(shù)組(Sham組): 在不結(jié)扎冠狀動脈的情況下行開胸手術(shù)，灌胃生理鹽水。術(shù)后8周對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評估，記錄體重、呼吸模式、活動量和毛色。

1.2 超聲心動圖

術(shù)后8周所有大鼠均行超聲心動圖檢查。麻醉滿意后，仰臥位固定，胸部備皮，測量室間隔收縮末期厚度(IVSS)、室間隔舒張末期厚度(IVSd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期后壁厚度(LVPWs)和左室舒張末期后壁厚度(LVPWd)。用Teichholtz方程計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸收縮分?jǐn)?shù)(LVFS)，并計(jì)算左心室舒張末期容積(LVEDV)和左心室收縮末期容積(LVESV)。大鼠手術(shù)后LVEF均低于50%, 提示心力衰竭。

1.3 左心室重量和肺重的測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測量心臟和左心室重量，計(jì)算左心室/體重比值(LVW/BW), 評價左心室肥厚程度。取肺稱重，計(jì)算肺臟重量指數(shù)(LUNGW/BW)作為充血指標(biāo)。

1.4 組織病理學(xué)檢查

處死大鼠后，提取左心室前壁組織。部分組織在液氮中快速冷凍，然后保存在-80 ℃以備分析。甲醛固定和石蠟包埋，切成4 μm的切片，烤片，冷卻后低溫凍存。經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化。蘇木精染色30～60 s, 沖洗5 min, 伊紅染色30 s, 沖洗5 min; 乙醇梯度脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察。其余組織采用戊二醛-鋨酸雙重固定，脫水，使用前置于-80 ℃中保存。在電鏡下進(jìn)行心肌超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.5 Western blot檢測

在組織裂解緩沖液中提取蛋白并測定蛋白濃度。從每個樣品中分離等量的蛋白質(zhì)(40 μg), 并將其電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%的BSA封閉，與一抗在4 ℃孵育過夜。洗膜3次后，將膜與HRP偶聯(lián)二抗孵育。使用標(biāo)準(zhǔn)ECL檢測條帶，并使用Image J軟件通過密度分析進(jìn)行定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 尼可地爾改善缺血性心力衰竭大鼠的一般情況

NS組大鼠除了呼吸急促甚至喘息外，還表現(xiàn)出活動減少和神經(jīng)松解，體重減輕，毛發(fā)顏色暗淡。NIC組大鼠的活動量、體重和整體健康狀況明顯好于NS組。術(shù)后8周, Con組、Sham組、NS組、NIC組體重分別為(486.70±29.30)g、(478.40±28.30)g、(369.85±47.26)g、(426.85±51.22)g, NS組體重最低, NIC組次之。

2.2 尼可地爾對缺血性心力衰竭大鼠的降壓作用

術(shù)后8周末, NIC組收縮壓和和舒張壓分別為(126.3±6.9)mmHg、(94.0±6.2)mmHg, 均明顯低于NS組的(141.7±10.1)mmHg、(103.1±5.9)mmHg的和Sham組的(159.6±11.3)mmHg、(113.1±8.5)mmHg, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NS組收縮壓(141.7±10.1)mmHg明顯低于Sham組(159.6±11.3)mmHg和Con組(150.8±10.2)mmHg, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Sham組舒張壓(113.1±8.5)mmHg與NS組(103.1±5.9)mmHg相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 尼可地爾改善缺血性心力衰竭大鼠的心功能

與Con組及Sham組相比, NS組及NIC組LVEF、E/A均降低，且NS組LVEF低于NIC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LVEDV則呈相反趨勢，3組間存在差異, NS組LVEDV最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NS組LVESV、LVIDd和LVIDs高于NIC組和Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NIC組和Sham組之間相關(guān)指標(biāo)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠的IVSd水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)水平比較

A: Sham組; B: NS組; C: NIC組

2.4 尼可地爾對缺血性心力衰竭大鼠左心室肥厚、纖維化和肺充血的影響

HE染色及電鏡下觀察結(jié)果均顯示, Sham組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，橫紋清晰; NS組心肌細(xì)胞排列紊亂，形狀不規(guī)則，還表現(xiàn)出明顯的纖維組織增生。與NS組相比, NIC組的這些異常明顯減弱，心肌纖維結(jié)構(gòu)趨于正常。Sham組和NIC組LVW/BW和LUNGW/BW均明顯低于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠LVW/BW和LUNGW/BW比較

A、E: Con組; B、F: Sham組; C、G: NS組; D、H: NIC組。

2.5 尼可地爾對大鼠心肌Akt/Bcl-2/Bax信號通路的影響

Western blot檢測顯示，與Con組及Sham組相比, NS組p-Akt、Bcl-2及Bax蛋白相對表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與NS組相比, NIC組p-Akt、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量更高，但Bax蛋白表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 4組p-Akt/Bcl-2/Bax蛋白水平表達(dá)圖

3 討 論

尼可地爾是第一種ATP依賴性鉀通道開放劑，作為一種新型血管擴(kuò)張劑在臨床實(shí)踐中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。尼可地爾具有雙重的血管擴(kuò)張機(jī)制[6]，通過刺激血管平滑肌細(xì)胞中的鳥苷酸環(huán)化酶起到硝酸酯類的作用，導(dǎo)致冠狀動脈血流量增加和靜脈擴(kuò)張[7]。此外，尼可地爾是一種ATP敏感性鉀通道開放劑，可引起血管平滑肌和線粒體鉀離子外流，使細(xì)胞電位超極化，誘導(dǎo)電壓門控鈣通道失活，減少細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子[8]，松弛冠狀動脈和阻力血管，增加流向心肌的血流量。尼可地爾還可擴(kuò)張全身阻力和容量血管，降低心臟前負(fù)荷和后負(fù)荷以及心肌耗氧量，緩解冠狀動脈痙攣，增加側(cè)支循環(huán)和心內(nèi)膜下血供[9]。本研究發(fā)現(xiàn)尼可地爾可改善缺血性心力衰竭大鼠的心功能，并在正常范圍內(nèi)降低血壓。

研究[10]表明，尼可地爾不僅能緩解缺血性心臟病的癥狀，還能抑制冠心病患者的心肌肥大和重塑。心力衰竭是最常見的心源性死亡原因，心臟重構(gòu)在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尼可地爾改善了缺血性心力衰竭大鼠的一般情況，且提高了LVEF、LVFS和E/A，降低了LVEDV、LVESV、LVIDd和LVIDs水平，改善了缺血性心力衰竭大鼠的左室收縮功能。尼可地爾干預(yù)后大鼠LVW/BW和LUNGW/BW比值也顯著低于NS組大鼠。本研究組織學(xué)觀察結(jié)果顯示, Sham組心肌細(xì)胞排列規(guī)則，橫紋清晰; Con組排列紊亂，形狀不規(guī)則，左心室心肌組織呈明顯的纖維組織增生; NIC組心肌細(xì)胞的這些病理改變不那么明顯，而且較少出現(xiàn)增生。這提示尼可地爾可改善缺血性心力衰竭時的心功能和左室重構(gòu)。

尼可地爾的保護(hù)機(jī)制尚未闡明。RAAS系統(tǒng)激活、氧化應(yīng)激和心肌內(nèi)鈣超載在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其中鈣超載對心功能影響最大[12]。尼可地爾可以開放線粒體中的鉀通道，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。研究[13]表明，尼可地爾作為NO供體，可能通過激活有絲分裂鉀通道和NO/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶依賴機(jī)制來抑制氧化應(yīng)激或高氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。此外，尼可地爾已被證明與凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)。Bcl-2與Bax共屬于一個家族，通過控制線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)凋亡激活物。bax二聚體在膜上打開通道，增加細(xì)胞膜通透性; bcl-2與bax可形成異聚體，降低細(xì)胞通透性[14]。bcl-2水平的升高和bax的降低表明細(xì)胞對凋亡的抵抗性增強(qiáng)，為保護(hù)藥物發(fā)揮作用的標(biāo)志。本研究中，尼可地爾抑制缺血性心力衰竭引起的大鼠心肌Bax水平的上調(diào)，提示尼可地爾對缺血性心力衰竭大鼠的心臟保護(hù)作用可能是通過抑制Bax的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。鑒于Bax的促凋亡作用，推測尼可地爾的保護(hù)作用可能參與控制缺血性心力衰竭大鼠的凋亡過程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，尼可地爾通過改善心功能和左室重塑對缺血性心力衰竭大鼠起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與尼可地爾抑制Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。