黑豆中大豆異黃酮超聲波法提取工藝優(yōu)化

王雙俠，蘇適，柴寶麗

（綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061）

大豆異黃酮是具有雌激素樣作用的天然活性物質(zhì)，故又叫植物雌激素，因其多樣而突出的生物學(xué)活性引起了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注[1]。大豆異黃酮主要來源于大豆，近年來黑龍江省黑豆的種植量在逐步增大，因此針對黑豆的綜合開發(fā)利用前景更為廣闊。目前，大豆異黃酮的提取主要有溶劑提取法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法、連續(xù)逆流提取法等，其中超聲波法與其它提取法相比，具有提取時間短、提取率高、成本低等優(yōu)點[2]。為此本實驗以黑豆為原料，采用超聲波法提取，考察提取因素對大豆異黃酮提取率的影響，以確定其最佳提取工藝。

1 實驗部分

1.1 實驗材料及儀器

高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；超聲波清洗器（上海皆準(zhǔn)儀器設(shè)備有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（浙江恒威電子科技有限公司）；黑豆（產(chǎn)自黑龍江省綏化）；金雀異黃酮對照品（酷爾化學(xué)科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

黑豆中大豆異黃酮的提取工藝流程：將黑豆置于60 ℃烘箱中干燥后粉碎，采用正己烷脫脂處理后備用[3]。精密稱取脫脂后黑豆粉10 g，加入250 mL 乙醇水溶液，超聲提取，過濾，揮干溶劑，溶解殘渣，測定大豆異黃酮含量并計算收率。

1.3 黑豆中大豆異黃酮含量的測定

1.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取金雀異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于50 mL 容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容。準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00, 0.05, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50 mL 置于10 mL 容量瓶中，分別加入5.0 mL 95%乙醇，蒸餾水定容。在波長259 nm 下測定吸光度。以金雀異黃酮濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=1 560.328 7X-0.078（R2=0.999 0）。

1.3.2 黑豆中大豆異黃酮提取率的計算

大豆異黃酮提取物溶液在波長259 nm 下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得金雀異黃酮的濃度[5]。

異黃酮提取率＝ cVf / w ×10-6× 100%

式中，c 為所測定大豆異黃酮的濃度（μg/mL）；V 為供試品定容體積（mL）；f 為提取液稀釋倍數(shù)；w 為原料重量（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上以乙醇濃度、物料粉碎度、超聲時間、提取溫度為考察對象，以大豆異黃酮提取率為指標(biāo)，選取四因素三水平對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用L9(34)表，因素水平正交設(shè)計見表1。

表1 正交實驗因素水平

采用正交實驗對超聲波法提取大豆異黃酮的工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表2。

對正交試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計和方差分析，從表2 中極差可以看出，各因素對黑豆中大豆異黃酮提取率影響的大小順序為乙醇濃度（A）＞超聲時間（B）＞提取溫度（C）＞物料粉碎度（D）；由表3 方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度對黑豆異黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05），超聲時間、提取溫度及物料粉碎度無顯著影響（P＞0.05）。從生產(chǎn)實際考慮，可以將提取工藝確定為A2B3C2D2，即物料粉碎后過20 目篩，以60%乙醇為溶劑，設(shè)定溫度為50 ℃，超聲提取50 min。

表2 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 提取率方差分析

2.2 驗證試驗

稱取黑豆粉末（20 目）3 份，每份10 g，按A2B3C2D2工藝，即采用60%乙醇，設(shè)定溫度為50 ℃，超聲提取50 min，測定大豆異黃酮并計算提取率，結(jié)果見表4。

由表4 可知，優(yōu)選的工藝重復(fù)性良好，3 次實驗大豆異黃酮提取率均在1.90%左右，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表4 驗證實驗結(jié)果

由于黑豆中含有較為豐富的脂類物質(zhì)，為了更好地提取出目標(biāo)成分，在提取之前采用正已烷為溶劑對提取原料進(jìn)行了脫脂處理，然后再經(jīng)過濃縮回收正已烷，正已烷為極低毒的重要化工溶劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及食品行業(yè)，常用于脫脂處理和植物油的萃取。

一般情況下，提取溫度越高，大豆異黃酮在提取溶劑中的溶解度越高，因此，在一定范圍內(nèi)提高提取溫度有利于提取率的提升。而實驗中發(fā)現(xiàn)，在提取溫度升為50℃以上后，大豆異黃酮的提取率提升變得并不明顯，隨著溫度的進(jìn)一步提高，提取率反而有下降的趨勢，這可能是因為過高的溫度會破壞大豆異黃酮的活性，而使其提取量下降[6-7]。從正交實驗的結(jié)果來看，較高濃度乙醇可使異黃酮類物質(zhì)增加滲透溶解，因而大豆異黃酮的平均提取率會隨著乙醇濃度的增加而提高，但乙醇濃度達(dá)到70%時，其提取率反而有小幅度的下降，這是因為當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，同時也增加了糖類物質(zhì)及蛋白質(zhì)等大分質(zhì)物質(zhì)的聚集，從而影響了異黃酮類物質(zhì)的析出[8]。另外，實驗發(fā)現(xiàn)粉碎度適當(dāng)提高，有利于提高大豆異黃酮的提取率，但粉末細(xì)度達(dá)到40 目以上后，提取率反而下降，考慮可能是因為粉末過細(xì)增加了后續(xù)過濾操作的難度，從而造成了一定的損失。在提取溫度及粉碎度兩個因素中，實驗從大豆異黃酮的提取率、操作難度及節(jié)能等綜合因素來考慮提取工藝的優(yōu)選。

3 結(jié)論

將黑豆置于60 ℃烘箱中干燥后粉碎，過20 目篩，以料液比1∶25 加入60%乙醇水溶液，設(shè)定溫度為50 ℃，超聲提取50 min，大豆異黃酮的提取率為1.91%，且工藝重復(fù)性良好。