紅曲菌深層發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀與展望

胡文林 謝鳳嬌 譚蘭英 覃愛紅 尚學平

廣東天益生物科技有限公司 廣東湛江 524300

紅曲的發(fā)明起源于中國，有千年以上的歷史。20世紀30～90年代，中國從事紅曲的研究和應用不多，發(fā)展也較緩慢。20世紀80年代后期，日本遠藤章教授等從紅色紅曲菌M.ruber中分離出Monacol K及結構相似的其他活性成分[1]，轟動了世界，又激起國人多方面的深入研究和應用。

隨著科學的發(fā)展，紅曲菌的潛能不斷被開發(fā)，才有了紅曲各種各樣的神奇功能，液體發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素，也是近二十年才發(fā)展起來的現(xiàn)代生物制品。剛開始，中國的紅曲色素是從紅曲米提取，它與液體發(fā)酵、純種培養(yǎng)所生產(chǎn)的紅曲紅相比，色價和純度及桔青霉素含量等均有差距，最終紅曲紅產(chǎn)品的安全性能得不到保障。

目前，全世界僅有中國和日本能生產(chǎn)紅曲色素，日本對紅曲的研究比較透徹，而中國的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和技術具有明顯優(yōu)勢。近幾年，中國海峽兩岸紅曲業(yè)界一致推崇紅曲，將其視為“國曲”，這是自然饋贈并蘊有人類智慧的寶物，值得國人珍惜。

隨著對紅曲菌發(fā)酵的研究，紅曲色素提取純化工藝的創(chuàng)新和改進，以及紅曲發(fā)酵產(chǎn)品中各種生物活性物質的發(fā)現(xiàn)，及其保健作用與藥理功能的闡明，紅曲色素在藥食兩用市場中將扮演著越來越重要的角色。紅曲色素在食品加工行業(yè)的使用范圍逐年增加，產(chǎn)品的市場需求量增長非常快，具有很大的市場潛力。本文主要介紹液體深層發(fā)酵紅曲色素的產(chǎn)業(yè)化進程、產(chǎn)業(yè)化工藝控制和紅曲的研發(fā)方向等方面的現(xiàn)狀。

1 紅曲霉菌液態(tài)發(fā)酵紅曲色素的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化進程

1.1 液態(tài)發(fā)酵紅曲色素的發(fā)展進程

20世紀80年代開始液體發(fā)酵紅曲的研發(fā)和中小試驗，發(fā)酵水平不到80u/mL；20世紀90年中期開始規(guī)?；a(chǎn)發(fā)酵罐體積為10m3，發(fā)酵色價最高達到約200u/mL；20世紀90年代末期發(fā)酵罐體積擴大為15m3，發(fā)酵色價最高達到約400u/mL；2004年規(guī)?；笊a(chǎn)發(fā)酵罐擴大到30m3，發(fā)酵水平色價從開始的200～300u/mL，經(jīng)過不斷的技術創(chuàng)新和工藝改造，2008年單罐發(fā)酵水平突破了900u/mL，最高達到920u/mL；2013年規(guī)模化大生產(chǎn)發(fā)酵罐擴大到60m3，平均發(fā)酵色價穩(wěn)定在750u/mL，到目前為止年平均發(fā)酵色價保持在800u/mL，單罐發(fā)酵水平最高達到870u/mL。

經(jīng)過二十多年的發(fā)展，深層發(fā)酵紅曲色素行業(yè)發(fā)酵水平取得了巨大的進步，隨著科學技術水平創(chuàng)新和提高，我們有信心將深層發(fā)酵紅曲色素的發(fā)酵色價突破1 000u/mL。

1.2 液體深層發(fā)酵紅曲色素的產(chǎn)業(yè)化工藝控制

液體深層發(fā)酵紅曲色素的技術經(jīng)過二十多年的發(fā)展，已日趨成熟、穩(wěn)定，較固態(tài)發(fā)酵優(yōu)勢明顯，具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、純度高、產(chǎn)品質量控制穩(wěn)定等優(yōu)點；配方、工藝可控性強，而且可以達到非常高的發(fā)酵水平。在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，主要通過菌種、原料、配方、工藝控制等措施，達到高產(chǎn)色素而低產(chǎn)或不產(chǎn)桔青霉素的目的，以及控制產(chǎn)品色調，使得產(chǎn)品質量(色調、色價和桔青霉素等指標)能夠得到有效的保障。

1.2.1 深層發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素工藝流程

平板于斜面培養(yǎng)7～8d→種子液培養(yǎng)24～30d→一級種子罐培養(yǎng)7～8h→二級種子罐培養(yǎng)7～8h→發(fā)酵罐培養(yǎng)70～80h→第一次壓濾→酒精浸提濾餅→第二次壓濾→濾液→納濾→真空濃縮→噴霧干燥→混粉篩粉→包裝→成品。

1.2.2 色調

紅曲色素是微生物發(fā)酵的天然色素的混合物，紅曲霉菌分泌的色素大致可分為理化性質相近的紫、紅、黃三種類型顏色。在生產(chǎn)實際應用中，由于成本等原因影響，并不將其分離提取，而是直接使用其混合物。

(1)在發(fā)酵過程中，因培養(yǎng)基不同，菌種分泌各種顏色色素比例亦各異，可以是通過調整培養(yǎng)基中的碳氮比例來實現(xiàn)。在培養(yǎng)基中，增大氮源，產(chǎn)生的色素就偏向于紫色；增大碳源，產(chǎn)生的色素則偏向于黃色；碳氮比例適中，產(chǎn)生的色素則為紅色。

(2)在提取過程中，用乙醇和水這2種方法提取得到的色素比例不同，色調也不同，在分光光度計測定的吸光度和最大吸收波長、波峰高低都存在差異。用2種方法提取的色素都有2個波峰分別在420nm和495nm，波長在420nm處是黃色，在495nm處是紅色，在各波長出現(xiàn)波峰的高低不同：醇溶性色素在波長495nm處要比波長420nm處出現(xiàn)波峰高得多，說明紅色色素比例較大，以紅色色調為主；水提取得到的色素恰好相反。

醇溶性和水溶性色素在不同的pH值范圍內均顯示不同的色調，大致可分成紅色、紫色、黃色3種顏色。用檸檬酸和食用堿調節(jié)pH值，其顏色變化如表1。

表1 不同pH值對色調的影響

因此，紅曲色素的色調與發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比例和提取工藝等因素有密不可分的關系，并非一成不變。

1.2.3 色價和桔青霉素

紅曲色素在食品、醫(yī)藥、化妝品等領域都有著重要的應用。但是紅曲色素產(chǎn)品中含有生物毒素——桔青霉素，此生物毒素具有腎毒性，還可致畸、致癌和誘發(fā)基因突變等[2]。桔青霉素的產(chǎn)生限制了紅曲產(chǎn)品的廣泛應用，并成為中國紅曲產(chǎn)品走向世界的瓶頸。提高色素生產(chǎn)水平和降低產(chǎn)品中的桔青霉素，是解決深層發(fā)酵紅曲行業(yè)的共性問題。桔青霉素是紅曲菌發(fā)酵次級代謝的產(chǎn)物之一，可以從菌種篩選、工藝優(yōu)化等方面進行控制[3]。

(1)紅曲優(yōu)良菌種的選育。

采用傳統(tǒng)的改造選育方法，對紅曲菌采用紫外誘變、化學誘變和復合誘變等方法，選育出性能穩(wěn)定、產(chǎn)色高，不產(chǎn)或低產(chǎn)桔青霉素的優(yōu)良菌種。

(2)原料的選擇和配方優(yōu)化。

經(jīng)過長期的生產(chǎn)試驗跟蹤得出：添加玉米漿作為生長因子對紅曲菌生成色素有明顯促進作用，且不促進桔青霉素的合成。添加無機鹽離子對產(chǎn)色和桔青霉素的合成也有不同程度的影響，Mg2+對紅曲菌產(chǎn)色基本無影響，而對桔青霉素的產(chǎn)生有較大的促進作用；Zn2+對色素合成的關鍵酶起激活作用，從而影響色素合成；Mn2+影響HMP途徑和TCA循環(huán)中某些酶的活性，而影響色素合成量。

(3)發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件的控制。

A：濃度比。

除了摸索紅曲菌高產(chǎn)色素低產(chǎn)或不產(chǎn)桔青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)配方外，碳氮比和料液濃度比最關重要，碳氮比控制2.5∶1較為合適；pH值3.0～4.5條件下最適合紅曲菌生產(chǎn)和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

B：溫度。

紅曲菌最適生長溫度為28～36℃，為了縮短生產(chǎn)周期，提高設備使用率，提高培養(yǎng)的溫度，可以達到更好的效果。在對菌種選育時，對紅曲菌在溫度為35～38℃進行處理，使得篩選菌種具有產(chǎn)色高、性能穩(wěn)定和培養(yǎng)粗放的特點；經(jīng)多次試驗表明：適當提高紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)溫度(35.5～36.5℃)，不但可以節(jié)能降耗，而且還能達到高產(chǎn)色素，降低桔青霉素。

C：通風比。

紅曲菌屬于好氧菌，在生產(chǎn)和發(fā)酵的培養(yǎng)過程中需要通入大量的壓縮空氣即通風量，確保培養(yǎng)基中有充足的溶氧，通風量會影響菌種的生長和代謝產(chǎn)物的分泌，同時也會影響發(fā)酵周期。實驗表明：通風比在1∶(0.3～0.6)時，菌種生長的每個時期所需的溶解氧會不一樣，應該進行適當?shù)恼{整，使得紅曲菌的生長期縮短，旺盛期延長，達到出現(xiàn)高產(chǎn)色素，低產(chǎn)或不產(chǎn)桔青霉素目的。

D：后提取精制工藝的革新。

提取及去除桔青霉素的工藝流程是發(fā)酵結束后，加酸將發(fā)酵液pH值調低，在較低的pH值情況下，色素及菌體充分沉淀，通過壓濾將含有桔青霉素的上清液分離，排除廢液得到濾餅。在濾餅中加入酒精進行色素萃取，萃取液借助納濾膜過濾除鹽，并通過真空濃縮的手段進行分離并回收酒精，將濃縮液加入糊精進行噴霧干燥得到產(chǎn)品，最后通過混粉將產(chǎn)品調節(jié)到相應規(guī)格并包裝成成品。

1.2.4 產(chǎn)品質量標準的檢測

目前，紅曲色素的質量標準主要是色價和桔青霉素等兩個關鍵指標。色價一檢測般采取比色法。桔青霉素的測定方法主要采用HPLC法、酶聯(lián)免疫法、TLC法、抑菌圈法等[4]；其中HPLC法是目前檢測紅曲中桔青霉素高效且應用最廣泛的方法，中國紅曲色素國家標準規(guī)定的方法是HPLC法，而國際上公認比較權威的檢驗方法是液相色譜-質譜聯(lián)機或液相二級質譜，該方法準確度和靈敏度都很高，但使用該方法的成本較為昂貴，目前無法廣泛使用。

經(jīng)過長期的連續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)驗證，公司在深層發(fā)酵紅曲色素技術方面取得了突破性的成果，得到了一套高產(chǎn)色素低產(chǎn)或不產(chǎn)桔青霉素的深層發(fā)酵工藝，解決了行業(yè)中存在的桔青霉素含量超標問題，紅曲色素產(chǎn)品桔青霉素含量達到中國和日本等國家的標準(如表2)，年平均發(fā)酵水平為800u/mL，發(fā)酵可年產(chǎn)1 200 t紅曲色素，是目前規(guī)模和產(chǎn)能最大的企業(yè)之一。

表2 深層發(fā)酵紅曲紅樣品桔青霉素含量的測定結果

2 固體發(fā)酵生產(chǎn)紅曲米工藝

傳統(tǒng)的紅曲米生產(chǎn)工藝為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)法，已有上千年的歷史。早期為地面表層培養(yǎng)，該方式投入少，操作簡單，但紅曲產(chǎn)量低且易受雜菌污染。20世紀80年代至今，主要采用通風曲池培養(yǎng)[7]，該方式采用液-固兩步法進行培養(yǎng)，即采用液態(tài)發(fā)式培養(yǎng)菌種，接種于固態(tài)物料，工藝上較固-固發(fā)酵有了較大的進步。

為進一步解決傳統(tǒng)紅曲米桔霉素超標和勞動強度大等行業(yè)難題，公司經(jīng)過長期的研究試驗，目前建成一條投料量8～10t的米機械化生產(chǎn)線，紅曲米色價達4 000～6 000u/g。該設備在借鑒日本單層曲室式圓盤自動制曲機基礎上，結合國內實際生產(chǎn)工藝而設計制造的固態(tài)發(fā)酵器(圓盤制曲機)，實現(xiàn)了機械化操作，蒸米、接種、出料、培養(yǎng)過程中的翻料，均由機械實現(xiàn)操作，在整個操作工程中，人與物料不直接接觸，避免了交叉污染。占地面積小，是行業(yè)中固體制曲的先進設備。

3 紅曲的研究與發(fā)展方向

自20世紀80年代以來，功能性紅曲中的Monacolin類化合物，被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并證實具有顯著抑制體內膽固醇合成的活性，Monacolin類化合物中Monacolink K是最主要的他汀類物質,是一類高效的降脂藥物，能有效地抑制膽固醇合成限速酶HMG-Coa還原酶的活性，降低人體內源性膽固醇合成，減少細胞內膽固醇貯存，降低血液中低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)的濃度[1]，因此，紅曲的保健和藥理作用得到了認可。而功能紅曲行業(yè)目前的生產(chǎn)方式(固體瓶式發(fā)酵)使得產(chǎn)能增加的局限性很大，技術水平難以提升，行業(yè)發(fā)展受限。21世紀初以來中國在液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方面做了大量工作，研究初見成效，采用這種生產(chǎn)方式有助于實現(xiàn)生產(chǎn)自動化，提高產(chǎn)品質量穩(wěn)定性，擴大生產(chǎn)規(guī)模，工藝調整靈活性強。

3.1 功能性紅曲生產(chǎn)的情況

3.1.1 功能紅曲的發(fā)酵方式

(1)固態(tài)發(fā)酵法[6]。功能性紅曲天然發(fā)酵可分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵2種發(fā)酵狀態(tài)。液態(tài)發(fā)酵法設備投資大、生產(chǎn)成本也較高。目前國內外降脂功能性紅曲的生產(chǎn)以固態(tài)發(fā)酵法為主。根據(jù)發(fā)酵容器，可分為三角瓶(或其它發(fā)酵瓶)發(fā)酵、淺盤發(fā)酵、固體發(fā)酵裝置發(fā)酵。大規(guī)模的固體發(fā)酵裝置從理論上來講是可行的，但設備投資大，有些技術尚不夠成熟，可用于功能性紅曲米的固態(tài)發(fā)酵罐系統(tǒng)還未達到實用化水平。因此，瓶式發(fā)酵和淺盤發(fā)酵是目前降脂功能性紅曲的主要生產(chǎn)方式。根據(jù)這種原始的生產(chǎn)方式，我們可以得出推論：真正發(fā)酵降脂功能性紅曲的生產(chǎn)成本一般比較高。

(2)液態(tài)發(fā)酵法[7]。液態(tài)發(fā)酵功能紅曲主要采用碳源、適量的氮源加水調成培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐進行滅菌、發(fā)酵的生產(chǎn)方式。優(yōu)勢比較明顯，自動化程度高，容易提高產(chǎn)能，工藝可控性強，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3.1.2 生產(chǎn)特點

(1)發(fā)酵周期長。紅曲中的功能性成分莫納可林K(MK)的合成屬于次級代謝產(chǎn)物，一般在菌體生長結束后才逐漸開始大量的合成。因此功能性紅曲的發(fā)酵周期相對較長。

(2)降脂功能性紅曲的特征。功能性紅曲樣品中莫納可林K(MK)均是同時含有開環(huán)結構和閉環(huán)結構的。在發(fā)酵10d及以前更是全部都是開環(huán)，不存在閉環(huán)。在其后的發(fā)酵過程中開環(huán)結構的莫納可林K(MK)比例一般在65%～85%，遠遠高于閉環(huán)結構。但功能性紅曲產(chǎn)品的烘干工藝會造成這2種比例的變化。產(chǎn)品烘干過程中，溫度越高，烘干時間越長，則開環(huán)結構轉化為閉環(huán)結構的就越多[5]。目前關于功能性紅曲的檢測方法，輕工行業(yè)標準GB/T2847-2007《功能性紅曲米(粉)》中有比較全面的莫納可林K(酸式和內酯式)的檢測方法，但2003年版衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中關于洛伐他汀的檢測，只用內酯型(即閉環(huán))的洛伐他汀的數(shù)據(jù)來表示檢測結果，這不能客觀的反映功能性紅曲樣品的特征(即2種結構共存，一般情況下內酯式比例高于酸式)，會大大制約其在保健品中的應用。

3.2 菌種的活化和分離純化[8]

3.2.1 斜面菌種的活化

將冰箱保存的斜面菌種接種于麥芽汁斜面，置32℃恒溫箱培養(yǎng)7d，備用。

3.2.2 斜面菌種的分離純化

將活化的斜面菌種制備單孢子懸液，然后稀釋涂平皿，培養(yǎng)，待平板上長出單個菌落，接種試管斜面，如此反復若干次，直至分純?yōu)橹埂?/p>

3.2.3 孢子懸液的制備

斜面菌株培養(yǎng)7d，用約10mL無菌水洗下斜面紅曲霉孢子，倒入已滅菌裝有20～30顆直徑為4～5mm玻珠的三角瓶中，振蕩約5min，孢子分散即可，稀釋至濃度為105個/mL。

3.2.4 種液制備

裝液量200mL/1 000mL三角瓶，接種量5%，置于轉速為200rpm的搖床，30℃恒溫培養(yǎng)48h。

3.2.5 固體發(fā)酵培養(yǎng)

裝料量150g/1 000mL三角瓶(150g指干重)，接種量10%～15%,25℃培養(yǎng)30d。30d后烘干，再用高效液相色譜法進行莫納可林K(MK)含量測定。

3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在固體發(fā)酵的最初階段，一般選用單一的原料作為固體發(fā)酵的培養(yǎng)基，如大米、小米、燕麥、玉米等，但最終莫納可林的含量都不是很高，同時還存在產(chǎn)生桔青霉素過高的風險。目前一般選用2種或以上原料進行復配發(fā)酵，以提高含量，降低或消除桔青霉素的含量。

3.4 開發(fā)研究方向[9]

加強對現(xiàn)有科研成果的開發(fā)應用，生產(chǎn)具有時代意義的新型紅曲保健食品、飲品和藥品，更好地為人們健康服務。本著預防為主的現(xiàn)代社會觀念，加強對高血脂癥的早期治療，做好心腦血管疾病的一級預防，顯得尤為重要。目前，已在日本和中國臺灣成功上市的紅曲保健食品：紅曲清酒、米醋、高鹽分食品(醬油、味噌、紅豆腐乳)、肉制品、面食、低膽固醇雞蛋及雞肉的生產(chǎn)。中國大陸也有較大的進步，市場上也有少量的紅曲餅干、面條、酒、肉醬等保健食品。隨著對紅曲相關知識的宣傳和普及，國人對紅曲的了解越來越深入。紅曲的保健和藥用價值也得到人們的認可，其相關產(chǎn)品也深受國人喜愛，市場需求量將迅速增長。因此，我們對紅曲保健食品的的研究開發(fā)力度還要加大，并且要多元化發(fā)展。期待與國內外科研院校、企業(yè)合作，共同促進紅曲行業(yè)的發(fā)展，使得國寶東方神曲能遍布神州大地。

4 展望

隨著中外的專家學者對紅曲菌研發(fā)的不斷深入，對人體有益的功能性成分越來越清晰、明確，紅曲菌能產(chǎn)生多種對人類有益的代謝產(chǎn)物：ACE抑制肽和-氨基丁酸(GABA，降血壓)，支鏈氨基酸(減肥)，Dimerumic酸(護肝)、黃酮酚(抗氧化)，麥角固醇(預防骨質疏松)，輔酶Q10(抗衰老)。紅曲的功效成分對調節(jié)血脂、心血管系統(tǒng)、抑制膽固醇合成、保護腎臟和肝臟、抗癌、防衰老抗氧化等方面都有明顯的藥理作用，采用紅曲菌深層發(fā)酵法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是未來發(fā)展的趨勢和方向，這也是深層發(fā)酵的優(yōu)勢所在。可以通過對菌種改良和篩選、液體發(fā)酵工藝優(yōu)化、代謝產(chǎn)品基因調控、生成機制、多菌種混合發(fā)酵等方面措施綜合控制，促進紅曲菌定向代謝功能性有效成分，提高發(fā)酵水平和產(chǎn)能，讓紅曲產(chǎn)品變得越來越普遍，發(fā)展前景十分廣闊。