喜樹堿對宮頸癌SiHa細胞的抑制作用及其機制探討

梁小婷,康慧琳

(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系,汾陽 032200;2孝義市人民醫(yī)院檢驗科;*通訊作者,E-mail:l568375113@163.com)

宮頸癌是威脅全球女性健康的常見惡性腫瘤之一,全球每年都有約二十幾萬的女性死于宮頸癌。近年來宮頸癌患者的年齡分布有明顯的走低趨勢[1],對女性的身心健康造成很大的影響,也為家庭帶來很重的經(jīng)濟負擔(dān)[2]。常規(guī)傳統(tǒng)的宮頸癌臨床治療方案包括手術(shù)切除、放射療法、化學(xué)療法或采取綜合性的系統(tǒng)治療手段[3]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展,運用而生多種宮頸癌的新型治療手段,比如分子靶向治療、免疫治療等多種治療手段[4]。早期的宮頸癌患者的治療效果較好,生存率較高。對于晚期以及持續(xù)性和復(fù)發(fā)性患者來說治療效果較差[5]。其中化學(xué)療法目前主要用于新輔助化療、增敏化療、術(shù)后或放化療后的輔助治療、姑息性化療等[6]。近年來隨著新型化療藥物的不斷出現(xiàn),給藥途徑和方法的不斷改進,化學(xué)療法在治療宮頸癌中取得了很好的療效[7]。因此研究和開發(fā)新型化療藥物,對于維持女性的宮頸健康有著非常重要的意義。

喜樹堿(camptothecin,CPT)來源于珙桐科植物喜樹,是一種從喜樹中提取出的五環(huán)吲哚生物堿[8]。CPT是一種傳統(tǒng)的化療藥物,廣泛地應(yīng)用于多種癌癥,例如白血病、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等[9]。CPT主要通過抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(Topo Ⅰ)影響DNA的復(fù)制,進而促進細胞凋亡。雖然CPT可以作用于多種癌癥,但是關(guān)于CPT作用于宮頸癌的報道較少,尤其是對于人子宮頸鱗癌細胞SiHa鮮有報道,對其作用機制也尚未闡明。因此本研究為了明確CPT對SiHa細胞的促凋亡作用,并初步探討CPT作用于SiHa細胞的分子機制,為臨床上進一步研究CPT的抗癌機制和應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

喜樹堿(CAS號:7689-03-4)購于上海阿拉丁公司;二甲基亞砜(DMSO)、MTT粉劑、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購于北京索萊寶公司;DAPI染液購于武漢博士德公司;Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Ⅰ試劑盒購于北京全式金公司。

1.2 儀器

多功能自動酶標儀購于美國伯騰公司;流式細胞儀購于美國BD公司;熒光顯微鏡購于日本尼康公司;核酸定量儀購于北京普析通用公司;熒光定量PCR儀購于美國賽默飛公司。

1.3 細胞株

人子宮頸鱗癌SiHa細胞系山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院饋贈。胎牛血清、胰酶、青-鏈霉素和細胞培養(yǎng)基DMEM(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 細胞培養(yǎng)與分組

細胞培養(yǎng)采用DMEM高糖培養(yǎng)基,其中加入10%的胎牛血清,1%的青-鏈霉素。在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長至80%融合左右,進行細胞傳代與實驗。設(shè)置對照組(常規(guī)培養(yǎng)組)和不同濃度喜樹堿(CPT)處理組,不同濃度喜樹堿處理組在常規(guī)培養(yǎng)基中加入1,5,10,50 μmol/L的喜樹堿。

1.5 MTT法檢測細胞增殖活性

取對數(shù)生長期的SiHa細胞制備成1×104個/ml單細胞懸液,以每孔100 μl接種在96孔板中,邊緣孔中加入無菌PBS,防止實驗操作孔中水分蒸發(fā)影響實驗結(jié)果,同時設(shè)置空白孔,空白孔中不添加任何液體。將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱,待細胞貼壁后棄去上清。對照組每孔中加入100 μl DMEM細胞培養(yǎng)基,實驗組中加入100 μl含喜樹堿的DMEM培養(yǎng)基,使得喜樹堿的終濃度為1,5,10,50 μmol/L。將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中,干預(yù)24 h或48 h取出,每孔加入10 μl MTT,4 h后棄去上清,加入150 μl DMSO,用酶標儀測定培養(yǎng)板在570 nm處的吸光度值。計算公式:細胞存活率=[(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%;細胞抑制率=[(A對照孔-A實驗孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。以上實驗重復(fù)3次。

1.6 熒光染色法觀察細胞核形態(tài)學(xué)變化

取對數(shù)生長期的SiHa細胞制備成1×105個/ml單細胞懸液,以每孔2 ml接種于6孔板中,將6孔板放入細胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后棄去上清。對照組加入2 ml細胞培養(yǎng)基,實驗組分別加入終濃度為5,10,50 μmol/L的喜樹堿細胞培養(yǎng)液。加藥干預(yù)24 h,取出6孔板,棄去上清,用PBS緩慢沖洗細胞表面2次,用4 ℃的多聚甲醛固定15 min。固定后用PBS輕輕洗滌3次,每次5 min,注意不要沖洗掉細胞。避光的條件下加入濃度為0.1 μg/ml的DAPI染液15 min,染色后劇烈洗滌3次,每次5 min。熒光顯微鏡波長340 nm下觀察SiHa細胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

與1.6同樣的方法處理細胞。加藥干預(yù)24 h,取出6孔板,棄去上清,用PBS緩慢沖洗細胞表面2次。使用Binding buffer將細胞重懸成1×105個/ml的細胞懸液。在細胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC染液,室溫、避光10 min后加入PI染液,避光孵育后加入Binding buffer,上機檢測。

1.8 real-time PCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平變化

與1.6同樣的方法處理細胞。加藥干預(yù)24 h,采用TransZol Up法提取各組細胞內(nèi)的總RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用核酸定量儀定量,調(diào)整合適的反應(yīng)溫度及時間(94 ℃先預(yù)變性30 s;94 ℃再變性5 s;50-60 ℃退火15 s,72 ℃延伸10 s,共40-45個循環(huán)),然后上機。通過實時熒光定量PCR法比較各組間細胞內(nèi)GADPH、Bax、Bcl-2基因的表達含量。引物序列見表1。

表1 擴增引物序列表

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 喜樹堿對SiHa細胞的生長抑制作用

MTT結(jié)果顯示,CPT作用于SiHa細胞24,48 h,可以明顯地抑制SiHa細胞的生長,與對照組相比,CPT組細胞存活率明顯下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。且各濃度組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖1,2),呈劑量依賴性。

與對照組相比較,**P<0.01;與1 μmol/L CPT組相比,#P<0.05;與5 μmol/L CPT組相比,△△P<0.01;與10 μmol/L CPT組相比,&P<0.05

與對照組相比較,**P<0.01;與1 μmol/L CPT組相比,##P<0.01;與5 μmol/L CPT組相比,△P<0.05;與10 μmol/L CPT組相比,&P<0.05

2.2 喜樹堿對SiHa細胞核形態(tài)學(xué)影響的檢測

SiHa細胞經(jīng)不同濃度的CPT(5,10,50 μmol/L)處理后,采用熒光顯微鏡檢測細胞核的形態(tài)變化。經(jīng)CPT處理后,SiHa細胞的細胞核出現(xiàn)濃染,細胞核開始固縮,隨著CPT濃度的不斷加大,核固縮較明顯,50 μmol/L的CPT作用于SiHa細胞后,細胞核進一步濃縮,顏色發(fā)白呈亮藍色,部分細胞核出現(xiàn)核碎裂,顯示出典型凋亡細胞的核特征(見圖3)。表明CPT可以導(dǎo)致SiHa細胞出現(xiàn)明顯的細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。

圖3 不同濃度的CPT對SiHa細胞核形態(tài)學(xué)的影響

2.3 喜樹堿對SiHa細胞凋亡率影響的檢測

為了進一步量化凋亡作用,采用流式細胞術(shù)檢測經(jīng)Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染的細胞。結(jié)果顯示,與對照組相比,CPT組凋亡率明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在0-50 μmol/L的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大細胞凋亡率也在不斷增高,各濃度組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01,見圖4,表2),呈劑量依賴性。

圖4 不同濃度的CPT對SiHa細胞凋亡率的影響

表2 CPT作用于SiHa細胞24 h后細胞的凋亡率

2.4 喜樹堿對SiHa細胞凋亡基因mRNA表達水平的影響

不同濃度的CPT(1,5,10,50 μmol/L)作用于SiHa細胞后,Bax基因的表達呈增長趨勢,與對照組相比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。在0-50 μmol/L的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大細胞內(nèi)Bax基因的表達也在不斷增高,各濃度組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖5),呈劑量依賴性。

與對照組相比,*P<0.05;與1 μmol/L CPT組相比,#P<0.05;與5 μmol/L CPT組相比,△P<0.05;與10 μmol/L CPT組相比,&&P<0.01

相反,與對照組相比,Bcl-2基因的表達呈下降趨勢,不同濃度CPT組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。在0-50 μmol/L的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大細胞內(nèi)Bcl-2基因的表達也在不斷降低,各濃度組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖6),呈劑量依賴性。

與對照組相比,*P<0.05;與1 μmol/L CPT組相比,#P<0.05;與5 μmol/L CPT組相比,△P<0.05;與10 μmol/L CPT組相比,&P<0.05

3 討論

宮頸癌是威脅全球女性健康的一類重大疾病。根據(jù)美國癌癥協(xié)會報道,2020年美國宮頸癌患者將會新增加13 800例,預(yù)計死亡人數(shù)達到4 290例[10]。宮頸癌的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療。近年來抗癌化學(xué)藥物的迅猛發(fā)展,過去認為對宮頸癌無效的化療現(xiàn)在已經(jīng)被認為是非常重要的一種治療方式,尤其是宮頸癌晚期或者復(fù)發(fā)者效果顯著[11]。

細胞凋亡是指由基因決定的細胞自動結(jié)束生命的過程,主動而有序,整個過程受到嚴格的遺傳機制的調(diào)控[12]。凋亡產(chǎn)生的損傷作用是癌癥治療的較為有效的重要思路。喜樹堿是一種植物抗癌藥物,對多種腫瘤細胞均有抑制生長的作用[13]。研究表明,喜樹堿可以誘導(dǎo)多種細胞發(fā)生凋亡,例如胃腸道癌癥和頭頸部癌癥。也有研究報道,喜樹堿對宮頸癌細胞有明顯的抑制生長的作用,但多為研究喜樹堿或羥基喜樹堿對HeLa細胞的作用[14,15]。目前喜樹堿對宮頸鱗癌SiHa細胞的研究報道較少[16],探究其作用機制的文章更少。為了研究喜樹堿對宮頸鱗癌SiHa細胞的影響,采用MTT法將不同濃度的喜樹堿作用于SiHa細胞并觀察其生長狀況。實驗結(jié)果表明,不同濃度的喜樹堿對SiHa細胞有明顯的抑制作用,并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。進一步研究喜樹堿對SiHa細胞的抑制作用是否通過抑制細胞凋亡來產(chǎn)生,進而進行了形態(tài)學(xué)實驗。研究表明,喜樹堿作用與SiHa細胞后,出現(xiàn)典型的凋亡特征,核分裂的染色質(zhì)凝聚,并逐漸出現(xiàn)凋亡小體。為了進一步量化細胞凋亡率,Annexin Ⅴ/PI雙染后采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。不同濃度的喜樹堿作用于SiHa細胞后,細胞凋亡率明顯升高,與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

Bcl-2家族蛋白包含抗凋亡蛋白(主要包括Bcl-2、Bcl-xL等)和促凋亡蛋白(主要包括Bax、Bak等)[17]。Bax和Bcl-2是線粒體通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。當細胞受到凋亡信號刺激時,Bax轉(zhuǎn)移到線粒體上,并使線粒體發(fā)生變化進而促使細胞凋亡。整個過程中Bcl-2必須與Bax結(jié)合才能發(fā)揮作用。研究表明,Bcl-2表達升高,Bax表達下降,兩者形成異二聚體抑制細胞凋亡。反之,兩者形成同二聚體促進細胞凋亡[18]。本實驗中,不同濃度的喜樹堿作用于SiHa細胞后,Bcl-2的表達降低,Bax的表達升高,說明喜樹堿可能通過線粒體通路促進SiHa細胞凋亡,進而抑制SiHa細胞的生長。但是實驗沒有進一步從蛋白水平驗證,有待于進一步的完善。

總之,本研究證明,喜樹堿作用于宮頸鱗癌SiHa細胞,可以顯著地抑制SiHa細胞的生長。其作用機制可能通過線粒體通路促進SiHa細胞發(fā)生凋亡,為臨床中宮頸癌的治療提供了一定的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。