杧果Whirly基因鑒定及其在病菌侵染過程中的表達(dá)分析

孫 宇，劉志鑫，葉 子，羅睿雄，蒲金基，張 賀*

(1 海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228；2 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；3 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，?？?71101)

Whirly蛋白是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)，主要定位于葉綠體和線粒體中，具有既能與單鏈DNA結(jié)合，也能與RNA結(jié)合的功能[1]。Desveaux等[2]于2000年從馬鈴薯中分離出第一個(gè)Whirly家族成員PBF-2，后來又稱為StWHY1[3]，它可以和cDNA編碼的蛋白質(zhì)都以序列特異性的方式與病原響應(yīng)基因PR-10a啟動(dòng)子上的順式應(yīng)答元件ERE(elicitor response element)以單鏈形式結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)該基因的表達(dá)并調(diào)節(jié)由病原菌引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[2]。Whirly蛋白家族一般包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域:N端結(jié)構(gòu)域，是葉綠體或線粒體信號(hào)肽和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域；非常保守的Whirly結(jié)構(gòu)域，是與單鏈DNA結(jié)合的區(qū)域，其中還包含一段細(xì)胞核定位信號(hào)；C端多變區(qū)，是具有自我調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)域，可調(diào)節(jié)單鏈DNA和Whirly蛋白的結(jié)合活性[3-4]。隨后，在擬南芥[1]、玉米[5-6]和番茄[7]等植物中[8-11]陸續(xù)鑒定到Whirly基因家族成員的存在，廣泛的分布表明它們可能在植物的生長(zhǎng)發(fā)育與生理過程中起著非常重要的作用。

Whirly蛋白功能發(fā)揮通過依賴于單鏈DNA的堿基及堿基與疏水氨基酸殘基的堆疊和疏水鍵作用進(jìn)行結(jié)合，還依賴其四倍體結(jié)構(gòu)[4,11]。目前已知Whirly蛋白能與4種核酸序列相結(jié)合：端粒末端序列[12]、ERE元件[2,13-14]、AtKP1基因啟動(dòng)子上的KPRE元件[15]、WRKY53基因啟動(dòng)子上的ERE-like基序與AT富集區(qū)序列[16]。除了ERE-like和AT富集區(qū)的序列以外，其余3種核酸序列之間無(wú)明顯的相似性。近年來的研究表明，擬南芥和馬鈴薯中的Whirly蛋白家族具有調(diào)節(jié)防御基因表達(dá)的功能[3]，其可能在防御反應(yīng)之外的過程中發(fā)揮作用，也可能在葉綠體與細(xì)胞核中發(fā)揮作用。Whirly蛋白不僅在細(xì)胞核內(nèi)參與水楊酸依賴的抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2,12]、調(diào)節(jié)端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[14]和調(diào)節(jié)葉片衰老[16-18]，而且在質(zhì)體和線粒體內(nèi)能夠維持其基因組穩(wěn)定[19]、DNA損傷修復(fù)[20]、調(diào)節(jié)質(zhì)體基因的表達(dá)[5,19-22]和控制角果的發(fā)育[18]，另外在胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)[6,23]等方面也發(fā)揮著重要的功能。Whirly基因不僅在非生物脅迫中發(fā)揮作用，在生物脅迫中也起著積極調(diào)節(jié)作用，比如番茄SlWHY2在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)可對(duì)青枯病菌侵染表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性[7]，辣椒中CaWHY2的表達(dá)受疫病的誘導(dǎo)，在2 h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到最高值，為對(duì)照的2.3倍[10]。

杧果(Mangiferaindica)，是世界著名的熱帶水果之一，在熱帶和亞熱帶地區(qū)的100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)中分布，包括中國(guó)的華南熱區(qū)[24]，是熱區(qū)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，也是農(nóng)民脫貧致富的“金杧果”和“致富樹”。隨著2020年?yáng)x果全基因組測(cè)序的完成[25]，杧果基因功能的研究進(jìn)程明顯加快，然而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)杧果Whirly基因家族的研究還未見報(bào)道。為此，本研究對(duì)杧果Whirly基因家族成員的序列特征及其表達(dá)特性進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步研究Whirly家族成員在杧果生長(zhǎng)發(fā)育中的功能和作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 杧果病害脅迫處理

杧果嫁接苗由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海南儋州杧果種質(zhì)資源圃提供(品種為‘貴妃杧’)。將株高約60 cm均勻一致的杧果嫁接苗移栽到花盆內(nèi)，以室溫25 ℃、相對(duì)濕度70%～90%、光/暗周期為12 h/12 h條件下進(jìn)行病害脅迫處理。設(shè)置Cg與Xcm 2個(gè)處理，每個(gè)處理3株苗，0 h處理作為對(duì)照組。以分生孢子濃度為2×106個(gè)/mL的膠孢炭疽菌分生孢子懸浮液、濃度為2×107cfu 的細(xì)菌性黑斑病菌懸浮液分別對(duì)杧果嫁接苗葉片均勻噴霧，取樣時(shí)間分別為處理后0、3、6、12、24、48、72 h，將杧果葉片剪碎，液氮速凍，保存在-80 ℃下待用。

1.2 方 法

1.2.1 杧果全基因組數(shù)據(jù)的來源杧果全基因組數(shù)據(jù)由NCBI(PRJNA487154)公布得知，玉米(Zeamays)、煙草(Nicotianatabacum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蘋果(Malusdomestica)、番茄(Solanumlycopersicum)、菠蘿(Ananascomosus)、水稻(Oryzasativa)、木薯(Manihotesculenta)、毛果楊(Populustrichocarpa)9個(gè)物種的基因組和Whirly基因家族信息分別來源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.2 杧果Whirly基因家族成員的鑒定從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)獲取AtWHY1、AtWHY2和AtWHY3氨基酸序列，并將其作為查詢對(duì)象在杧果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中執(zhí)行Blastp比較，將E值設(shè)置為10-5。使用Pfam工具 (http://pfam.xfam.org/)檢測(cè)得到的杧果蛋白序列結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步去除沒有典型Whirly結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，最終得到所有杧果Whirly基因家族成員[26]。其他9個(gè)代表物種中的Whirly基因家族成員采用類似的方法進(jìn)行篩選。

1.2.3 杧果Whirly基因家族的生物信息學(xué)分析通過使用ProtParam在線分析工具(http//web.Expasy.org/protpasam/)預(yù)測(cè)氨基酸數(shù)、蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均親水性等理化性質(zhì)[27]。利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)杧果基因家族的蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析[28]，再通過DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行高同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)。通過在線工具SOPMA(https://www.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用NCBI Conserved Domain Search預(yù)測(cè)基因的保守結(jié)構(gòu)域，SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)蛋白質(zhì)保守域的四聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析利用ClustalW程序?qū)x果和9個(gè)物種中的Whirly基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。獲得Whirly蛋白序列后使用MEGA 7.0軟件，通過鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹，其中校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1 000次重復(fù)[29]。

1.2.5 RNA提取及cDNA合成對(duì)杧果葉片總RNA進(jìn)行提取，采用了RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)中的方法提取，使用超微量紫外分光光度計(jì)(Nano-drop2000C型)測(cè)定總RNA的濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩＠肦evertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄成第1鏈cDNA[30]。

1.2.6 杧果Whirly基因家族表達(dá)分析為研究?jī)煞N病原菌脅迫下杧果Whirly家族基因的差異表達(dá)情況，利用Quant Studio 6 Flex的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，采用UltraSYBR Mixture 試劑盒(北京康為世紀(jì))作為熒光試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作。建立20 μL的反應(yīng)體系，每個(gè)處理樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，45個(gè)循環(huán)；在60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。根據(jù)MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物MiWHY1-F / MiWHY1-R、MiWHY2-F / MiWHY2-R和MiWHY3-F / MiWHY3-R，以杧果Mi18S作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物Mi18S-F / Mi18S-R(表1)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀軟件(Quant StudioTM 6 Flex)獲得各個(gè)樣品的Ct值，以0 hpi的表達(dá)量為對(duì)照，運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，確定MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對(duì)表達(dá)量[31]。最后，將qRT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析兩種病原菌脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)差異。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組水平鑒定杧果Whirly基因家族成員

在杧果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp檢索，去除無(wú)典型Whirly結(jié)構(gòu)域的冗余序列和同一基因的非主要轉(zhuǎn)錄形式以后，發(fā)現(xiàn)杧果Whirly基因家族有3個(gè)成員，分別命名為MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3。通過生物學(xué)在線分析工具ProtParam (http:web.sxpasy.org/protparam/)對(duì)杧果Whirly基因家族3個(gè)成員MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明(表2)，MiWHY1氨基酸數(shù)為180個(gè)，蛋白分子量為20 294.28 Da，蛋白等電點(diǎn)為9.32，外顯子數(shù)為6，親水性平均數(shù)為-0.19，脂溶指數(shù)為92.06，不穩(wěn)定指數(shù)為45.32；MiWHY2氨基酸數(shù)為217個(gè)，蛋白分子量為24 512.89 Da，蛋白等電點(diǎn)為9.18，親水性平均數(shù)為-0.447，脂溶指數(shù)為68.66，不穩(wěn)定指數(shù)為55.66；MiWHY3氨基酸數(shù)為236個(gè)，蛋白分子量為26 260.89 Da，蛋白等電點(diǎn)為9.54，外顯子數(shù)為8，親水性平均數(shù)為-0.285，脂肪系數(shù)為75.64，不穩(wěn)定指數(shù)為42.44。因此，預(yù)測(cè)這3個(gè)蛋白均為不穩(wěn)定親水堿性蛋白。

2.2 杧果Whirly蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了更好地了解杧果Whirly基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將杧果(3個(gè))、玉米(6個(gè))、煙草(19個(gè))、擬南芥(4個(gè))、蘋果(3個(gè))、番茄(2個(gè))、菠蘿(1個(gè))、水稻(2個(gè))、木薯(3個(gè))、毛果楊(6個(gè))Whirly基因的蛋白序列通過BLAST工具進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析，利用ClustalW程序和MEGA 7.0軟件構(gòu)建3個(gè)杧果Whirly基因與其他物種(共9種)植物Whirly基因的蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，基于蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，Whirly家族蛋白具有多樣性，MiWHY1與木薯(Manes.01G189300.1)親緣關(guān)系最近，MiWHY2與毛果楊(Potri.010G092500.1)親緣關(guān)系最近，MiWHY3與番茄(Solyc11g044750.1.1)親緣關(guān)系最近，對(duì)于親緣關(guān)系較近的蛋白質(zhì)，推測(cè)它們具有相似或相近的生物學(xué)功能。

2.3 杧果Whirly蛋白保守基序分析

基于在線軟件MEME對(duì)杧果MiWHY1(GWHPABLA011035)、MiWHY2(GWHPABLA032351)、MiWHY3(GWHPABLA034174)；番茄PtWHY1(Solyc05g007100.2.1)、PtWHY2(Solyc11g044750.1.1)；毛果楊PtWHY1(Potri.003G048700.1)、PtWHY2(Potri.003G048700.2)、PtWHY3(Potri.008G149100.1)、PtWHY4(Potri.008G149100.2)、PtWHY5(Potri.008G149100.3)、PtWHY6(Potri.010G092500.1)；木薯MeWHY1(Manes.01G189300.1)、MeWHY2(Manes.02G200100.1)、MeWHY3(Manes.18G108600.1)基因家族的蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3與番茄、毛果楊、木薯的Whirly基因家族中鑒定出3個(gè)保守基序，其中共有1個(gè)高度保守的基序Motif1，Motif1再通過DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)(圖2)。保守基序Motif1含有49個(gè)氨基酸，包含20個(gè)百分之百保守的序列，杧果MiWHY1的保守基序位置為34～82；MiWHY2的保守基序位置為125～173；MiWHY3的保守基序位置為91～139。通過基序分析發(fā)現(xiàn)，Whirly基因家族在進(jìn)化上結(jié)構(gòu)具有保守性。

圖1 10個(gè)Whirly蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed from 10 Whirly proteins

表2 杧果Whirly基因家族成員的基本信息

2.4 杧果Whirly蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過生物學(xué)在線分析工具SOPMA對(duì)MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明(圖3)，無(wú)規(guī)則卷曲(45.00%)和α-螺旋(30.00%)是MiWHY1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要元件，其次是延伸鏈(19.44%)和β-轉(zhuǎn)角(5.56%)；無(wú)規(guī)則卷曲(47.47%)和延伸鏈(26.27%)是MiWHY2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要元件，其次是α-螺旋(20.28%)和β-轉(zhuǎn)角(5.99%)；無(wú)規(guī)則卷曲(42.37%)和α-螺旋(29.66%)是MiWHY3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要元件，其次是延伸鏈(22.03%)和β-轉(zhuǎn)角(5.93%)。

MiWHY1～MiWHY3. 杧果；SlWHY1、SlWHY2. 番茄；PtWHY1～PtWHY6. 毛果楊；MeWHY1～MeWHY3. 木薯圖2 杧果與其他物種Whirly家族保守基序的多重序列比對(duì)MiWHY1-MiWHY3. Mangifera indica；SlWHY1，SlWHY2. Solanum lycopersicum；PtWHY1-PtWHY6. Populus trichocarpa；MeWHY1-MeWHY3. Manihot esculentaFig.2 Multiple sequence alignment of conserved motifs of Whirly family in mango and others

A. MiWHY1；B. MiWHY2；C. MiWHY3；橫坐標(biāo)表示氨基酸位點(diǎn)圖3 杧果Whirly家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)The abscissa indicates the position of the amino acid sequenceFig.3 Secondary structure prediction of Whirly family in mango

2.5 杧果Whirly蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

通過NCBI Conserved Domain Search對(duì)杧果Whirly家族和馬鈴薯StWHY1蛋白質(zhì)序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)杧果Whirly家族成員與馬鈴薯StWHY1含有的保守結(jié)構(gòu)域相同，均含有Whirly超家族保守域(圖4)。其中MiWHY1蛋白的Whirly超家族保守域位置為24～139(圖4，A)；MiWHY2蛋白的Whirly超家族保守域位置為95～212(圖4，B)；MiWHY3蛋白的Whirly超家族保守域位置為61～196(圖4，C)； StWHY1蛋白的Whirly超家族保守域位置為98～233(圖4，D)。

基于同源建模原理，通過SWISS-MODEL軟件對(duì)杧果MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3蛋白保守結(jié)構(gòu)域的四聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖5，A～C)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，它們?nèi)叩慕Y(jié)構(gòu)基本一致。其中，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3四聚體結(jié)構(gòu)與馬鈴薯(圖5，D)Whirly蛋白的四聚體結(jié)構(gòu)類似，根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能的原理，推測(cè)MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3四聚體在功能上也與馬鈴薯Whirly蛋白的四聚體具有相似性。

2.6 杧果Whirly基因家族脅迫響應(yīng)表達(dá)分析

以杧果Mi18S作為內(nèi)參基因，0 h處理作為對(duì)照組。利用qRT-PCR檢測(cè)并分析了兩種病原菌侵染過程中杧果Whirly家族基因的表達(dá)程度。其中，杧果膠孢炭疽菌(Cg)侵染過程中(圖6，A1)，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，并在24 h時(shí)達(dá)到最大值，其中MiWHY1的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的74.9倍，MiWHY2的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的15.5倍，MiWHY3的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的6.8倍，整個(gè)侵染過程中MiWHY1的相對(duì)表達(dá)量均高于MiWHY2和MiWHY3；杧果細(xì)菌性黑斑病菌(Xcm)侵染過程中(圖6，B1)，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對(duì)表達(dá)量在處理12 h前明顯下調(diào)，MiWHY1、MiWHY3相對(duì)表達(dá)量在12 h后顯著上調(diào)，隨后下調(diào)。將qRT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(圖6，A2、B2)，結(jié)果表明，在不同病原菌侵染過程中，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照差異性顯著。

A. MiWHY1； B. MiWHY2； C. MiWHY3；D. StWHY1；Query seq.查詢序列；Specific hits.特異位點(diǎn)；Superfamilies.超家族圖4 杧果Whirly蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Conserved domain analysis of Whirly proteins in mango

A. MiWHY1；B.MiWHY2；C. MiWHY3；D. 馬鈴薯 Potato圖5 杧果Whirly蛋白保守域四聚體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與馬鈴薯[4,11]Whirly蛋白四聚體結(jié)構(gòu)比較Fig.5 Comparison of the conserved domain tetramer structure of mango Whirly proteins with the structure of potato Whirly protein tetramer

A. 膠孢炭疽菌(Cg)；B. 細(xì)菌性黑斑病菌(Xcm)；*表示處理與對(duì)照在0.05水平上差異顯著圖6 杧果Whirly基因家族在不同病原菌脅迫下的表達(dá)與PCR產(chǎn)物電泳圖A. Cg；B. Xcm；* Indicates significant difference between treatments and control (CK) at 0.05 levelFig.6 Expression analysis of Whirly gene family in mango under different pathogen stress treatments and PCR product electrophoresis

3 討 論

基因組測(cè)序技術(shù)的提高和分子生物學(xué)研究的深入，為植物基因家族的鑒定、功能基因的挖掘提供了基礎(chǔ)，已經(jīng)成功對(duì)大量植物全基因組進(jìn)行測(cè)序。Whirly家族是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)。葉綠體、線粒體與細(xì)胞核是植物3個(gè)具有遺傳信息DNA的細(xì)胞器，保護(hù)DNA與維持遺傳信息的有序表達(dá)是植物生存與發(fā)育的關(guān)鍵，Whirly蛋白既定位于質(zhì)體又定位于細(xì)胞核，在質(zhì)體與細(xì)胞核中發(fā)揮著重要作用[4]。Whirly蛋白的結(jié)構(gòu)與生理功能十分復(fù)雜，盡管Whirly基因在雙子葉草本十字花科的模式植物擬南芥中的分子機(jī)制已經(jīng)得到了闡明[4,11]，但對(duì)豐富多彩的植物而言，仍很局限，僅僅是家族成員的數(shù)量上就差異很大，如CAM植物菠蘿有1個(gè)成員、茄科煙草有19個(gè)成員，家族成員的多樣性也暗示著其功能多種多樣。本研究的杧果是一種典型的漆樹科果樹，參照首次報(bào)道的馬鈴薯PBF-2(StWHY1)Whirly蛋白的四聚體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[2-3]和最為保守的Whirly結(jié)構(gòu)域序列，通過全基因組鑒定確定杧果有3個(gè)Whirly基因家族成員，均含有1個(gè)公認(rèn)的最為保守的Whirly結(jié)構(gòu)域[3-4]，四聚體結(jié)構(gòu)與馬鈴薯Whirly蛋白四聚體結(jié)構(gòu)具有高度相似性，推測(cè)它們?cè)诠δ苌暇哂幸恢滦?。Desveaux等[2]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯PBF-2四聚體由4個(gè)p24蛋白通過中心的螺旋-環(huán)-螺旋連接在一起，C4對(duì)稱分布形成，形態(tài)呈螺旋狀。此外，Whirly蛋白四聚體的β-片層結(jié)構(gòu)輻射向外，β-片層的邊緣及之間起到與單鏈DNA結(jié)合的作用，而β-片層上部則沒有單鏈DNA的結(jié)合，每個(gè)蛋白單體只可以結(jié)合9個(gè)核苷酸；3個(gè)α-螺旋向四聚體中心匯聚，從而形成一個(gè)直徑為0.8 nm且具有疏水功能的中心空穴在蛋白質(zhì)表面，有害物質(zhì)有可能被Whirly蛋白利用中心空穴進(jìn)行儲(chǔ)存，最終保護(hù)DNA免受脅迫的傷害[4]。

中國(guó)杧果病害危害嚴(yán)重，常見的病害有炭疽病、細(xì)菌性黑斑病、白粉病、蒂腐病、瘡痂病等[27]，其中，杧果膠孢炭疽病與細(xì)菌性黑斑病危害杧果最為嚴(yán)重[28-29]。為了研究杧果Whirly基因是否受膠孢炭疽菌與細(xì)菌性黑斑病菌侵染的誘導(dǎo)表達(dá)，本研究分別噴霧接種兩種病原菌于杧果葉片上，并通過qRT-PCR技術(shù)揭示膠孢炭疽菌與細(xì)菌性黑斑病菌侵染過程中杧果Whirly家族基因的相對(duì)表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)在不同病原菌侵染過程中，MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照差異性顯著，如MiWHY1、MiWHY2和MiWHY3在膠孢炭疽菌侵染后的3～72 h內(nèi)均顯著性上調(diào)表達(dá)，表明杧果Whirly基因響應(yīng)了病菌的侵染。Whirly基因的研究大多集中在模式植物擬南芥Whirly蛋白的結(jié)構(gòu)和功能上[1]以及干旱[7]、低溫[10]、鹽[11]等非生物脅迫對(duì)基因表達(dá)水平的影響方面，也有前人在研究中提到Whirly基因參與轉(zhuǎn)基因煙草青枯病菌[7]、辣椒疫霉菌[10]等生物脅迫的調(diào)控。本研究所用的兩種病原菌分別屬于刺盤孢屬真菌、黃單胞菌屬細(xì)菌，這兩個(gè)屬是生產(chǎn)中較為重要的病原菌，且Whirly基因響應(yīng)疫霉菌的侵染[10]，這暗示著Whirly基因?qū)Χ喾N病原菌的侵染均有響應(yīng)，可作為研究植物抗病機(jī)制的候選基因。