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    陜北黃土高原生物結(jié)皮中7種微藻的形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定

    2021-03-10 08:22:00祝亞芳黃興波程金鳳
    西北植物學(xué)報(bào) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:藻株結(jié)皮綠藻

    祝亞芳,黃興波,程金鳳

    (西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

    生物結(jié)皮(biological crusts)是在土生藻類拓殖作用下,由微小生物及其代謝產(chǎn)物與沙粒組成[1-3],是水分、有機(jī)物與土壤顆粒緊密結(jié)合在土壤表層形成的一種殼狀體[4],廣泛地分布在干旱半干旱地區(qū),其生物組成主要有藻類、地衣、苔蘚,以及真菌、細(xì)菌等[5-6]。其中的藻類是分布在土壤環(huán)境中的土生藻類,在生物結(jié)皮中占據(jù)重要組分[7]。土生藻類能利用自身的固碳、固氮作用增加土壤有機(jī)物含量[8-9],并通過藻體及其分泌物粘固沙粒形成活性生物結(jié)皮,從而提高土壤的生物活性[10],改善土表理化性質(zhì),起到抗風(fēng)蝕的作用。可見生物結(jié)皮中的藻類對固定土壤和促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)具有極其重要的作用。

    中國西北部的黃土高原是典型的干旱半干旱生態(tài)系統(tǒng),面臨著水土流失等諸多生態(tài)問題。在退耕還林的政策實(shí)施后,生物結(jié)皮便成為黃土高原典型的地表覆蓋類型,不同降雨量對其蓋度影響較大[11]。其中,李金峰等[12]在該地區(qū)發(fā)育初期的生物結(jié)皮中發(fā)現(xiàn)了50種藻類,大多是藍(lán)藻和綠藻;楊麗娜等[13]對該地區(qū)生物結(jié)皮中的藍(lán)藻多樣性進(jìn)行了研究。對于黃土高原生物結(jié)皮藻類的研究常見為數(shù)量及分布的研究,而利用分子手段對生物結(jié)皮藻類群落的系統(tǒng)學(xué)研究較少。本研究將對黃土高原生物結(jié)皮中的7種純化藻類進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定,并利用MrBayes 3.2.4對這幾種藻類進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析,為后續(xù)黃土高原生物結(jié)皮藻類的研究奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集及處理

    在陜北黃土高原不同區(qū)域的每塊樣地上,使用酒精浸泡過的環(huán)刀和土鉆采集生長良好的生物結(jié)皮樣品(10 cm × 10 cm)。將采集完整的生物結(jié)皮除去石塊、植物根系等雜物后,保存到牛皮紙信封內(nèi);將所有樣品編號標(biāo)記,陰干保存帶回實(shí)驗(yàn)室[14],在超低溫冰箱中保存。各采樣地點(diǎn)見表1。

    1.2 結(jié)皮藻類的培養(yǎng)與純化

    1.2.1 結(jié)皮藻類培養(yǎng)選擇合適的錐形瓶并加入80 mL的BG-11[15]培養(yǎng)基后進(jìn)行滅菌處理、冷卻備用。將室外采集的生物結(jié)皮拿到實(shí)驗(yàn)室內(nèi),選取發(fā)育良好的生物結(jié)皮,放入錐形瓶中充分混勻后置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將光照、光暗周期及溫度參數(shù)分別調(diào)至40%,10 h / 14 h,26 ℃,培養(yǎng)1周左右,培養(yǎng)期間隨時(shí)觀察生長情況,避免生長過旺或雜菌污染嚴(yán)重。

    表1 陜北黃土高原生物結(jié)皮采樣點(diǎn)信息

    1.2.2 藻類純化利用水滴稀釋法或平板法[16]對上述培養(yǎng)好的混合藻液進(jìn)行單藻種純化。首先將平板上長出的單個(gè)群落挑出放在倒置顯微鏡下觀察,若形態(tài)一致,將其轉(zhuǎn)入裝有5 mL無菌培養(yǎng)液的小瓶子中培養(yǎng);若形態(tài)不一致,則采用微吸管分離法或稀釋水滴分離法進(jìn)行純化。整個(gè)純化期間定時(shí)進(jìn)行鏡檢,直到觀察到的藻類形態(tài)一致為止,即純化完成。最后取對數(shù)生長期的藻液滴于載玻片上,制成臨時(shí)裝片,在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)皮微藻的形態(tài)并對其形態(tài)特征拍照。

    1.3 單藻種的分子鑒定

    1.3.1 DNA提取、擴(kuò)增與測序取對數(shù)生長期的藻液,3 000 r/min離心10 min,收集沉淀,稱取少量放到2 mL的離心管中,用CTAB方法進(jìn)行基因組DNA提取。用于擴(kuò)增綠藻5.8S+ITS2的引物序列為:正向5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,反向5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[17];用于擴(kuò)增藍(lán)藻的16S-23S rDNA的引物為:正向5′-TGTACACACCGGCCCGTC-3′,反向5′-CTCTGTGTGCCTAGGTATCC-3′[18]。PCR反應(yīng)體系(25 μL):ddH2O為9.5 μL、2×Taq MasterMix為12.5 μL、正反向引物各1 μL、DNA模板1 μL。擴(kuò)增完成后,雙向測序由西安擎科生物技術(shù)公司完成。

    1.3.2 貝葉斯(BI)樹構(gòu)建測序完成后數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件Geneious 9.0.2中,進(jìn)行拼接處理,將處理好的序列提交至GeneBank,利用Blast搜索引擎中的nucleotide blastn下載若干同源序列。然后,對所有序列進(jìn)行比對、排矩陣后,用jModelTest計(jì)算合適模型,最后用MrBayes 3.2.4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.3.3 遺傳距離分析遺傳距離計(jì)算在MEGA 7.0中進(jìn)行,將剔除外類群序列的上述文件導(dǎo)入MEGA中,并對序列進(jìn)行分組處理,之后在Distance分析選項(xiàng)中計(jì)算遺傳距離三角矩陣,其計(jì)算模型選擇K2P。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 7株結(jié)皮藻的形態(tài)特征

    本次研究從生物結(jié)皮中共純化出7種藻類,其中有5種綠藻(編號分別為SM-2-1、DB-2-1、DB-2-2、SD-1、SD-2)和2種藍(lán)藻(編號分別為YJ-3和YJ-2)。

    (1)綠藻:SM-2-1細(xì)胞為長圓形,兩端具有突出的尖,常見1或2個(gè)細(xì)胞組成,外有明顯的膠被包裹,細(xì)胞長約16.7 μm,色素體片狀周生,胞內(nèi)有1個(gè)明顯的蛋白核(圖1 a,b)。DB-2-1常見為2或4個(gè)細(xì)胞,由透明膠被包裹聚集,單個(gè)細(xì)胞為圓球形,直徑約為13.3 μm,色素體呈不規(guī)則狀周生,常見1個(gè)蛋白核(圖1 c,d)。DB-2-2為球形細(xì)胞,胞外有透明的膠被物質(zhì),常由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成,個(gè)體大小差異較大(直徑在15~40 μm間),色素體均勻分布在藻體細(xì)胞內(nèi)部,有多個(gè)蛋白核(圖1 e,f)。SD-1細(xì)胞為梭形或紡錘狀且兩端有細(xì)長的喙?fàn)钅┒耍麄€(gè)細(xì)胞長約80 μm,兩細(xì)長的喙?fàn)钅┒嘶疽恢拢伢w片狀分布在兩端、中間分布較少,具有1個(gè)蛋白核(圖1 i,j)。SD-2藻體呈單細(xì)胞圓球形,直徑約20 μm,個(gè)體間分散生長,色素環(huán)狀分布在細(xì)胞上,具有蛋白核(圖1 g,h)。

    藻類照片均為100倍油鏡下的光學(xué)照片(標(biāo)尺=10 μm)。其中,a、b.SM-2-1; c、d.DB-2-1; e、f.DB-2-2;g、h.SD-2;i、j.SD-1; k~m.YJ-2; n~p.YJ-3圖1 7種結(jié)皮藻的形態(tài)特征The above photos of algae are optical photos under 100x oil microscope, bar=10 μm. a, b. SM-2-1; c, d. DB-2-1; e, f. DB-2-2; g, h. SD-2; i, j. SD-1; k-m. YJ-2; n-p. YJ-3Fig.1 Morphological characteristics of seven species of biological crust algae

    (2)藍(lán)藻:YJ-3的藻絲體外側(cè)有明顯的鞘,常見鞘內(nèi)多個(gè)藻絲體有規(guī)律地纏繞在一起呈束狀,有時(shí)鞘內(nèi)也只出現(xiàn)一個(gè)藻絲體,鞘有收縊現(xiàn)象,單個(gè)藻絲體寬約8.4 μm,束狀寬約33.3 μm,細(xì)胞長寬分別為6.3 μm和3.0 μm,藻體呈藍(lán)綠色(圖1,n~p)。YJ-2通常單個(gè)藻絲體出現(xiàn),有時(shí)也會多個(gè)藻絲相互纏繞出現(xiàn),細(xì)胞間有收縊,細(xì)胞長約3.2 μm,寬約1.6 μm,無外鞘,藻體呈藍(lán)綠色(圖1,k~m)。

    2.2 藻株核酸序列分析

    從形態(tài)上初步斷定5株編號為SM-2-1、DB-2-1、DB-2-2、SD-1和SD-2的結(jié)皮藻為綠藻門植物,進(jìn)行5.8S+ITS2核酸序列擴(kuò)增,序列長度分別為664 bp、663 bp、662 bp、589 bp和688 bp,其中GC含量分別為33.43%、49.47%、50.15%、50.76%和51.01%;藻株YJ-3和YJ-2判定為藍(lán)藻,16S-23S rDNA序列擴(kuò)增長度分別為570 bp和465 bp,序列GC含量分別為46.31%和49.03%,圖2為7株結(jié)皮藻擴(kuò)增片段電泳圖。利用Blast搜索引擎中的nucleotide blastn對獲得的5.8S+ITS2序列和16S-23S rDNA序列進(jìn)行比對,結(jié)果顯示如下:

    SM-2-1藻株5.8S+ITS2序列與Acutodesmusreginaes CCAP 27666(JQ082326)的比對序列相似度最高(96%),存在2個(gè)堿基差異位點(diǎn)。DB-2-1藻株與多條比對序列相似性均高達(dá)100%,無堿基差異。DB-2-2藻株序列與雨生紅球藻H(HaematococcuspluvialisH,GQ463618)序列高度相似(99%),同時(shí)與多種衣藻目(Chlamydomonadales)藻株序列相似(95%左右)。SD-1藻株比對序列與水生境中的環(huán)藻科Ankyra屬兩藻株序列[19](HQ219412、HQ219430)只發(fā)現(xiàn)一個(gè)堿基差異點(diǎn),相似度高達(dá)97%,與Atractomorphaporcatastrain SAG 71.90(KM020065)的5.8S+ITS2序列相似性為91%,存在22個(gè)堿基差異位點(diǎn)。SD-2的5.8S+ITS2序列與真眼點(diǎn)藻科(Eustigmataceae)多個(gè)藻株序列高度相似,其中與大真眼點(diǎn)藻(EustigmatosmagnusSAG 2370)存在1個(gè)堿基差異位點(diǎn),序列相似性高達(dá)99%。藻株YJ-3的16S-23S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫GeneBank中比對出來的序列相似度都不高,其中序列相似度最高的是偽魚腥藻科(Pseudanabaenaceae)藻株,僅為87%,且有10個(gè)位點(diǎn)存在差異。藻株YJ-2的16S-23S rDNA比對序列與細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)藻株序列相似度高,其中與Haloleptolyngbyasp. PMC 895.15(MH182758)的比對序列相似度最高(100%),無堿基差異。

    圖2 7株結(jié)皮藻DNA擴(kuò)增片段電泳圖Fig.2 The electrophoresis patterns of DNA amplified fragments of seven species from biological crust algae

    2.3 BI樹與遺傳距離分析

    2.3.1 結(jié)皮綠藻系統(tǒng)樹分析將結(jié)皮分離藻株的5.8S+ITS2序列或16S-23S rDNA序列進(jìn)行同源比對后,下載一些相似性高的序列,通過剪切、排矩陣后,利用MrBayes 3.2.4軟件進(jìn)行建樹分析。

    對結(jié)皮綠藻的BI樹(圖3)進(jìn)行分析可以得出,這5株綠藻可分為4個(gè)分支,從上到下分別為柵藻科(Scenedesmaceae)、衣藻目(Chlamydomonadales)、環(huán)藻科(Sphaeropleaceae)、真眼點(diǎn)藻科(Eustigmataceae)。其中,DB-2-1和SM-2-1 都屬于柵藻科。DB-2-1與Scotiellopsisreticulate的4個(gè)物種聚在一支且支持率為100%,且與這4株藻之間的遺傳距離均為0.000,綜合兩種分析結(jié)果得出DB-2-1藻株應(yīng)該歸于Scotiellopsis屬。SM-2-1與Acutodesmusreginae單獨(dú)聚在一起,支持率為64%,兩者間的遺傳距離最小(0.041),并與NCBI相似性搜索比對結(jié)果一致,因此應(yīng)該歸于尖帶藻屬(Acutodesmus)。SD-1所在的分支為環(huán)藻科,與淡水生境的Ankyra屬藻株共為一支,支持率為82%,遺傳距離小于0.057,系統(tǒng)發(fā)育樹與遺傳距離分析結(jié)果一致,而SD-1形態(tài)與Ankyra屬藻種形態(tài)極為相似,因此SD-1最有可能是環(huán)藻科Ankyra屬物種。SD-2與真眼點(diǎn)藻科真眼點(diǎn)藻屬(Eustigmatos)藻株聚為一支,且與大真眼點(diǎn)藻SAG2370(EustigmatosmagnusSAG2370)的遺傳距離最小0.008,與真眼點(diǎn)藻屬的其他藻種的遺傳距離也都小于0.02,與同源比對結(jié)果相結(jié)合可確定SD-2最有可能是真眼點(diǎn)藻屬藻種(Eustigmatos)。DB-2-2與一種雨生紅球藻(HaematococcuspluvialisH)和一種土生紅球藻‘Haematococcussp.’(MF482915)聚為一支,支持率為84%,遺傳距離分別為0.005、0.026,通過對DB-2-2的形態(tài)觀察以及序列比對分析后,其應(yīng)歸于紅球藻屬(Haematococcus)。

    圖3 5株結(jié)皮綠藻5.8S+ITS2的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Bayesian phylogenetic tree of 5.8S+ITS2 from five strains of green algae with biological crusts

    2.3.2 結(jié)皮藍(lán)藻系統(tǒng)樹分析對藍(lán)藻貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)分析顯示,YJ-3和YJ-2聚在一大類分支偽魚腥藻科(Pseudanabaenaceae)中,從BI樹中能明顯的發(fā)現(xiàn)這2株藍(lán)藻分別歸于不同的屬。YJ-3與偽魚腥藻科(Pseudanabaenaceae)藻株KC525096聚為一支,支持率為100%,兩者間遺傳距離為0.273,遺傳距離值偏大,這與上述NCBI同源序列分析結(jié)果一致,因此YJ-3可能為偽魚腥藻科一新物種。YJ-2與細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)的2個(gè)藻種歸為一個(gè)分支,節(jié)點(diǎn)支持率為100%,但YJ-2藻絲無鞘,同時(shí)遺傳距離較大分別為0.314和0.327,與其序列相似度最高的是Haloleptolyngbyasp.PMC895.15但兩者間的遺傳距離較遠(yuǎn),因此YJ-2也有可能是細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)親緣關(guān)系較近的一新物種。

    圖4 2株結(jié)皮藍(lán)藻16S-23S rDNA的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Bayesian phylogenetic tree of 16S-23S rDNA from two strains of cyanobacteria with biological crusts

    3 討 論

    目前國內(nèi)對生物結(jié)皮藻類多樣性的研究主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征來鑒定,該方法較為費(fèi)時(shí)且需要具有多年藻類形態(tài)鑒定經(jīng)驗(yàn),但是多數(shù)藻類在不同環(huán)境及發(fā)育階段的形態(tài)特征會有所不同,因此僅憑形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行藻種鑒定是非常困難的。近年來,藻類分子系統(tǒng)學(xué)在其分類、系統(tǒng)發(fā)育發(fā)生和分子進(jìn)化等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[20-21],多種DNA保守序列(如16S-23S、ITS等)分析越來越多地用于藻類分子系統(tǒng)研究中[18,22],確保了鑒定的準(zhǔn)確性。本次實(shí)驗(yàn)通過形態(tài)觀察并利用5.8S+ITS2和16S-23S rDNA序列分別對純化的結(jié)皮綠藻與藍(lán)藻完成鑒定,為后續(xù)黃土高原生物結(jié)皮藻類的研究奠定部分理論基礎(chǔ)。

    本研究對7種結(jié)皮藻的系統(tǒng)發(fā)育分析及形態(tài)鑒定可初步確定到屬的水平。在5株結(jié)皮綠藻5.8S+ITS2序列比對分析中發(fā)現(xiàn),該序列在多數(shù)屬內(nèi)差異小、非常保守,極易確定到屬。DB-2-1屬于Scotiellopsis屬、SM-2-1屬于尖帶藻屬(Acutodesmus),均隸屬于柵藻科。柵藻科植物體為真性定性群體,常見多個(gè)藻體細(xì)胞平行或上下交錯(cuò)排列、少數(shù)藻以單細(xì)胞,藻體形態(tài)多樣,只有1個(gè)周生色素體和一個(gè)蛋白核。DB-2-1與Veronika Kaufnerová[23]文中ScotiellopsisreticulateCCALA474的形態(tài)一致,無論是從形態(tài)還是序列分析都支持DB-2-1是Scotiellopsis屬中的一種。SM-2-1形態(tài)符合尖帶藻屬的描述[24],但是尖帶藻屬胞外無膠被而該藻種胞外存在膠被,很有可能是該屬的新種。DB-2-2與雨生紅球藻 H(HaematococcuspluvialisH)同源性序列最為相似,同時(shí)與另外一株紅球藻屬野生藻株(MF482915)聚為一支,因此本文建議DB-2-2歸于紅球藻屬(Haematococcus)。SD-1形態(tài)特征較像弓形藻屬(Schroederia),但系統(tǒng)發(fā)育分析與序列比對表明其為Ankyra屬物種,與Yong Jae Kim文中[25]對環(huán)藻Ankyrajudayi的形態(tài)描述相符,但是兩者生境截然不同,Ankyrajudayi為水生環(huán)境而SD-1則是在較為干旱的陜北黃土高原生物結(jié)皮中分離的,這與沙漠綠藻起源于淡水藻的推論相吻合。根據(jù)分析SD-2可能是真眼點(diǎn)藻屬(Eustigmatos)物種,而真眼點(diǎn)藻是一種單細(xì)胞土生藻,具有高產(chǎn)油和可溶性多糖特性,因此基于這兩方面的研究較多,如吳桂秀等[26]。藻株SD-2在生物結(jié)皮中分離得到,與真眼點(diǎn)藻屬生境相符,可能對生物結(jié)皮的形成和發(fā)育起著極其重要的作用。另外2株結(jié)皮藍(lán)藻中,YJ-3經(jīng)分子序列分析表明其應(yīng)歸于偽魚腥藻科,與之歸為一支的偽魚腥藻(KC525096)生境為阿塔卡馬沙漠[27],生境相同但在序列中存在多個(gè)堿基差異且遺傳距離值偏大,其較可能為偽魚腥藻內(nèi)的一個(gè)新種。YJ-3形態(tài)為多條藻絲組裝成緊密的繩索結(jié)構(gòu),這種超強(qiáng)繩索結(jié)構(gòu)在功能上使藍(lán)藻能夠在泥沙及侵蝕的不穩(wěn)定環(huán)境中成為生態(tài)穩(wěn)定的開拓者,在傳統(tǒng)分類學(xué)上又是幾個(gè)屬定義的基礎(chǔ)特性,特別是微鞘藻屬(Microcoleus)和水鞘藻屬(Hydrocoleum)[28]。YJ-2與BI樹中聚在同一分支的細(xì)鞘絲藻(Leptolyngbya)比對結(jié)果存在4%的堿基差異,而與藻株Haloleptolyngbyasp. PMC895.15相似度高達(dá)100%且無堿基差異,但是YJ-2與三者的遺傳距離都較遠(yuǎn),而YJ-2形態(tài)觀察并無外鞘,可能為偽魚腥藻科細(xì)鞘絲藻屬親緣關(guān)系較近的一新物種。Patzelt D. J.[27]在對沙漠土壤藍(lán)藻多樣性的研究中可以看出細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)呈現(xiàn)多樣性,在偽魚腥藻科多個(gè)分支中都有出現(xiàn),還有部分以外類群出現(xiàn),因此對于細(xì)鞘絲藻屬還需進(jìn)行深入的分類研究。本研究觀察發(fā)現(xiàn),在這7株結(jié)皮藻中,有一半的藻體外部形態(tài)特征具有鞘或者膠囊。這些鞘或者膠囊是微藻以不同形式排出的EPS[29],能參與沙粒的黏附,促進(jìn)生物結(jié)皮形成。

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