冰片對(duì)鼻咽癌細(xì)胞容積敏感性氯通道的激活作用

孟 龍，王海波，鄧志欽，汪 源，伍嘉寶，賴周毅，呂瑞玲，孫曉雪，朱林燕，陳麗新，王立偉

（暨南大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系、2.醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，廣東 廣州 510632）

冰片（borneol）又稱龍腦、龍腦香，是一個(gè)雙環(huán)單萜醇，具有芳香開竅、清熱止痛，消炎消腫等作用；近來研究發(fā)現(xiàn)冰片作用廣泛，冰片對(duì)顱腦缺血／再灌注損傷有抑制作用［1］，可消除早期手術(shù)或外傷引起的腦細(xì)胞及組織水腫；冰片在肛腸外科也應(yīng)用廣泛，在消腫止痛方面效果明顯［2］，但冰片消除細(xì)胞腫脹及組織腫脹的機(jī)制卻不清楚。

氯通道是人體各種細(xì)胞上內(nèi)分布最廣的陰離子通道。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，氯通道阻斷劑可引起等滲環(huán)境中的細(xì)胞體積增大，提示氯通道在生理狀態(tài)下仍有少量開放，參與細(xì)胞的基本形態(tài)調(diào)節(jié)，保持細(xì)胞內(nèi)外水平衡。用低滲溶液灌流細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞體積先增大，后回縮，趨向于原來的體積，容積敏感性氯通道的開放在其中起著重要作用［3］。文獻(xiàn)報(bào)道，冰片的消腫作用不僅因?yàn)楸哂幸种茡p傷組織產(chǎn)生炎癥因子，更有明顯消除組織細(xì)胞腫脹的作用［4－5］。冰片的抑制細(xì)胞腫脹是否與容積敏感性氯通道有關(guān)？目前未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究冰片能否激活氯通道，探討冰片的消除細(xì)胞腫脹作用是否與容積敏感性氯通道有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 低分化鼻咽癌細(xì)胞（CNE-2Z）用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，并加入雙抗：10萬 IU·L－1青霉素、0.1 g·L－1鏈霉素；在 5%CO2，37℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)方法培養(yǎng)，間隔48 h傳代1次。實(shí)驗(yàn)前用0.25%胰酶消化、收集并重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液接種在直徑22 mm的圓形玻片上，放入培養(yǎng)箱使細(xì)胞貼壁，待細(xì)胞貼壁1 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物試劑 冰片購置于上海純優(yōu)生物科技有限公司，純度：≥98%（HPLC），用二甲基亞砜（dimethyl sulpoxide，DMSO）配置成 20 mmol·L－1儲(chǔ)存液。使用前用等滲灌流液稀釋至終濃度20μmol·L－1。Tamoxifen購于 Sigma公司，用 DMSO配制為20 mmol·L－1儲(chǔ)存液，使用前用等滲溶液稀釋至20 μmol·L－1。

1.3 膜片鉗實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞外灌流液 等滲灌流液（isotonic solution）含（mmol· L－1）：70 NaCl，0.5 MgCl2，2 CaCl2，10 HEPES，140 D-mannitol，滲透壓為300mOsmol· L－1；高滲液（47%hyper）滲透壓為440 mOsmol·L－1，除溶液中含280 mmol· L－1的D-mannitol外，其余成分均同于等滲灌流液。配制好的液體用Osmomat030冰點(diǎn)滲透壓計(jì)（Osmomat030；Gonotec，Germany）測(cè)定滲透壓，Tris堿調(diào)pH值至7.4。

1.3.2 電極內(nèi)液 使用特配的溶液記錄氯電流，電極內(nèi)液含（mmol· L－1）：70 N-methyl-D-glucamine chloride（NMDG-Cl），1.2 MgCl2，1 EGTA，10 HEPES，140 D-mannitol，2 ATP。

1.3.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄 指數(shù)增殖期的CNE-2Z細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后，吹打配制成單細(xì)胞懸液，接種于直徑22 mm的圓形玻片上，在5%CO2，37℃飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞貼壁1 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用微電極拉制器（PB-7）拉制電極，灌入電極內(nèi)液后微電極前端電阻為5～10 MΩ。用EPC-7膜片鉗放大器（HEKA，Darmstadt，Germany）記錄單細(xì)胞的全細(xì)胞氯電流。用CED 1401（Cambrige，UK）采集電流和電壓信號(hào)，采樣頻率為3 kHz。全細(xì)胞電壓鉗制模式在0、±40和±80 mV反復(fù)循環(huán)，脈沖波寬設(shè)置為200 ms，脈沖間隔為4 s。用EPC軟件（CED，Camridge Electronic Design，UK）記錄并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

將貼壁細(xì)胞玻片放在特制的灌流裝置中，全細(xì)胞記錄方式記錄CNE-2Z細(xì)胞膜電流。記錄穩(wěn)定的背景電流3～5 min，加入20μmol·L－1冰片溶液灌流細(xì)胞，觀察并記錄激活電流的潛伏期、電流密度等。電流達(dá)到峰值并平穩(wěn)后，加入20μmol· L－1tamoxifen氯通道阻斷劑溶液，觀察氯通道阻斷劑對(duì)冰片激活電流的影響。計(jì)算氯通道阻斷劑對(duì)冰片激活電流的抑制率。抑制率的計(jì)算公式為：抑制率／% ＝［（Cmax－CIso）－（CBlockers－CIso）］／（Cmax－CIso）×100%，其中 CIso是等滲溶液中的基礎(chǔ)電流值，Cmax是冰片激活的電流最大值，CBlockers是加入阻斷劑后的最大效應(yīng)時(shí)的電流值。在觀察冰片激活氯通道的容積敏感性實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)冰片激活細(xì)胞電流達(dá)到峰值并穩(wěn)定后，換為含同等濃度冰片的高滲灌流液，觀察滲透性細(xì)胞容積縮小對(duì)冰片激活氯電流的影響。

1.4 細(xì)胞體積測(cè)量 將已經(jīng)貼壁的細(xì)胞玻片放入特制的灌流槽中，放在倒置顯微鏡下，選定好理想的視野，按特定的拍攝要求設(shè)定拍攝程序，用Image-Pro Plus圖像分析軟件控制數(shù)字式攝像機(jī)動(dòng)態(tài)拍攝，制成序列文件。用Scion Image圖像分析軟件對(duì)拍攝的圖片進(jìn)行處理，測(cè)量細(xì)胞的面積并使用Sigma Plot軟件按以下公式計(jì)算細(xì)胞體積：V＝4／3×π×（S／π）3／2。對(duì)細(xì)胞體積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；公式為：V st＝V t÷V a×100%；V t為冰片作用后細(xì)胞體積，V a是藥物處理前等滲灌流液作用時(shí)細(xì)胞體積的平均值。細(xì)胞容積縮小率的百分率計(jì)算：V%＝（VIso－Vmin）÷VIso×100%；VIso是藥物處理前等滲灌流液時(shí)細(xì)胞的體積。Vmin是藥物處理后細(xì)胞的最小體積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，分別采用方差分析（ANOVA）或配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 冰片激活CNE-2Z細(xì)胞電流 如Fig 1A所示，冰片可以激活CNE-2Z細(xì)胞電流。在細(xì)胞外灌流等滲溶液時(shí)，細(xì)胞的基礎(chǔ)電流很小，在＋80 mV電壓鉗制下，外向電流密度（6.73±3.6）pA·pF－1，在－80 mV電壓鉗制下，內(nèi)向電流密度為（－6.34±3.5）pA·pF－1。當(dāng)換用 20μmol·L－1冰片溶液灌流細(xì)胞后，可以明顯激活一個(gè)電流，其潛伏期為（5.1±0.6）min（n＝16）。外向電流較大（78.85±4.88）pA·pF－1（＋80 mV），內(nèi)向電流較小（－52.36±4.41）pA·pF－1（－80mV），呈現(xiàn)明顯的外向優(yōu)勢(shì)（Fig 1B、D），無時(shí)間及電壓依賴性的失活（Fig 1C，D）。該電流的翻轉(zhuǎn)電位（－5.18±0.70）mV。接近本實(shí)驗(yàn)條件氯離子平衡電位理論值（－0.9 mV），提示冰片激活的電流為氯電流。

2.2 氯通道阻斷劑tamoxifen對(duì)冰片激活電流的抑制作用 tamoxifen（tam）是常用的氯通道阻斷劑，本實(shí)驗(yàn)觀察了tamoxifen對(duì)冰片激活電流的作用。如Fig 2A所示，用冰片激活CNE-2Z細(xì)胞電流后，細(xì)胞外灌流20μmol·L－1tamoxifen可以完全抑制該電流。在不同鉗制電壓條件下，tamoxifen作用前后的電流密度見Fig 2B，在＋80 mV電壓鉗制時(shí)，tamoxifen使外向電流從（78.7±9.56）pA／pF下降到（8.89±2.81）pA／pF（n＝5，P＜0.01），抑制率為（98.02±2.73）%；＋80 mV電壓鉗制時(shí)，內(nèi)向電流從（－52.59±10.84）pA／pF下降到（－7.25±1.95）pA／pF（n＝5，P＜0.01），抑制率為（101.57±5.35）%，tamoxifen對(duì)內(nèi)、外向電流的抑制率差異無顯著性（n＝5，P＞0.05）。Fig 2C，D分別顯示在冰片、冰片加tamoxifen條件下的細(xì)胞電流瞬時(shí)圖。用來配制tamoxifen儲(chǔ)存液的DMSO在灌流液中的終濃度低于1‰，其對(duì)冰片激活的電流沒有影響。本結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)冰片激活的電流是氯通道介導(dǎo)的氯電流。

Fig 1 Borneol-induced currents in CNE-2Z cells（xˉ±s，n＝5）A：The time course of Borneol-activated currents in CNE-2Zcells；B：The current-voltage relationship of Borneol activated currents in CNE-2Z cells.**P＜0.01 vs Iso；Cellswere clamped at0，±40 mV、±80 mV repeatedly；C：Traces of background currents recorded in the isotonic solution（Iso）；D：Traces of Borneol-induced currents.

2.3 冰片激活氯電流的容積敏感性 Fig 3A顯示了冰片激活的氯電流被440mOsmol·L－1高滲溶液抑制的全過程，細(xì)胞外灌流20μmol· L－1冰片等滲溶液后，激活外向優(yōu)勢(shì)的氯電流，當(dāng)該電流達(dá)到峰值并穩(wěn)定后；灌流含20μmol· L－1冰片的47%高滲溶液，內(nèi)、外向氯電流被迅速而完全地抑制。換回含冰片的等滲溶液后，電流可恢復(fù)（數(shù)據(jù)未顯示）。Fig 3B電流－電壓曲線顯示在等滲、高滲不同條件下，冰片激活的氯電流密度差異有顯著性（n＝5，P＜0.01），表明在細(xì)胞外高滲條件下，細(xì)胞皺縮，容積縮小，可導(dǎo)致冰片激活的氯通道關(guān)閉，提示冰片激活的氯電流具有明顯的容積敏感性。

2.4 冰片對(duì)CNE-2Z細(xì)胞體積的影響 在特制的浴槽中持續(xù)細(xì)胞外灌流20μmol·L－1的冰片溶液，在倒置相差顯微鏡下連續(xù)拍攝細(xì)胞圖像，觀察冰片對(duì)細(xì)胞體積的影響。如Fig 4A所示，細(xì)胞外灌流等滲溶液時(shí)CNE-2Z細(xì)胞體積比較穩(wěn)定，在觀察的50 min內(nèi)細(xì)胞體積無明顯改變。而冰片引起較明顯的細(xì)胞體積縮?。‵ig 4B），當(dāng)細(xì)胞外灌流含20μmol·L－1冰片（Borneol）的溶液 30 min后，與加冰片前對(duì)照相比較，細(xì)胞體積減小（9.44±1.6）%（n＝16，P＜0.01）。在去除冰片后，細(xì)胞體積趨于穩(wěn)定，沒有進(jìn)一步縮小，但未恢復(fù)至原來水平。氯通道阻斷劑tamoxifen對(duì)冰片引起的細(xì)胞體積縮小有抑制作用（n＝16，P＜0.01）。如 Fig 4C（n＝15）所示，在灌流氯通道阻斷劑后加入冰片，細(xì)胞體積無縮小。

Fig 2 Inhibition of Borneol-activated currents by tamoxifen（x±s，n＝5）A：The time course of inhition of Borneol-activated currents by tamoxifen（Tam）；B：Current-voltage relationships.**P＜0.01 vs Borneol；C：Current traces of Borneol-induced currents；D：Current traces showing inhibition of Borneol-activated currents by tamoxifen.

Fig 3 Inhibition of Borneol activated currents by 47%Hypertonic solution（±s，n＝5）A：The time course of inhibition of Borneol-activated currents by 47%Hypertonic solution；B：Current-voltage relationships.**P＜0.01 vs Borneol.

Fig 4 Changes of the CNE-2Z cell volume induced by BornolA，B，C show CNE-2Z cells bathed in different solutions；D shows CNE-2Z cells bathed in the three experiment conditions for different time periods.Upper line shows CEN-2Z cells bathed in isotonic solution，middle line shows CNE-2Z cells bathed in borneol solution，bottorn line shows CNE-2Z cells bathed in tamoxifen solution with Borneol.

3 討論

冰片是我國常用中藥之一。冰片常用于通諸竅、散郁火、去翳明目、清熱止痛消腫。冰片可單用，在軟組織腫脹消腫治療中作用明顯，也可配伍其它藥物共同使用。研究發(fā)現(xiàn)冰片具有抑制組織分泌炎癥因子作用，但冰片消腫的機(jī)制并不清楚。

我們前期的研究表明，氯通道參與細(xì)胞的多種基本生理功能調(diào)節(jié)，如細(xì)胞容積調(diào)節(jié)［6］、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)［7］，細(xì)胞凋亡［8］及參與紅細(xì)胞溶血［9］等。研究表明［6］，當(dāng)細(xì)胞外灌流低滲溶液時(shí)，細(xì)胞體積脹大，激活容積敏感性氯通道，細(xì)胞內(nèi)Cl－及水外流，使腫脹細(xì)胞恢復(fù)到或接近到原來的體積，這一過程稱細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積縮小（regulatory volume decrease，RVD）；Cl－是細(xì)胞 RVD的關(guān)鍵離子，氯通道被激活，Cl－及水的外流是細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積縮小的主要機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)使用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，直接觀察冰片對(duì)氯離子通道的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞外灌流等滲的冰片溶液可激活一個(gè)有明顯外向優(yōu)勢(shì)的電流，并在不同的電壓鉗制下電流的方向與Cl－運(yùn)動(dòng)的方向一致；再者據(jù)細(xì)胞外灌流液及電極內(nèi)液分析，鉀、鈉陽離子的平衡電位都比較高可達(dá)100 mV以上，而該電流的翻轉(zhuǎn)電位為（－5.18±0.70）mV比較接近Cl－的平衡電位，這提示冰片激活的電流為氯電流。氯通道阻斷劑tamoxifen完全抑制此電流，進(jìn)一步證實(shí)冰片激活的電流為氯通道介導(dǎo)的氯電流。

冰片對(duì)炎癥因子等所致的細(xì)胞腫脹有消腫作用，其機(jī)制是否與氯通道有關(guān)，目前沒有報(bào)道。本結(jié)果顯示冰片激活容積敏感性氯通道，導(dǎo)致細(xì)胞容積減小，該作用可被氯通道阻斷劑tamoxifen所抑制，表明冰片通過開放氯通道，引起氯離子及水外排，導(dǎo)致細(xì)胞體積縮小。提示容積敏感性氯通道可能是冰片對(duì)細(xì)胞消腫作用的靶點(diǎn)之一。冰片激活的氯電流可以被細(xì)胞外灌流高滲溶液抑制，該電流無明顯時(shí)間及電壓依賴性并被氯通道阻斷劑tamoxifen阻斷，這些特征與我們前期報(bào)道的低滲激活容積敏感性氯通道的特征很相似［10］，但冰片激活的氯通道和低滲溶液激活鼻咽癌細(xì)胞容積敏感性氯通道的激活途徑可能不同，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 李 歡，夏鑫華，劉 梅 ，等.麝香配伍冰片干預(yù)局灶性腦缺血－再灌注損傷的代謝組學(xué)研究［J］.中藥材，2012，35（8）：1274－9.

［1］ Li H，Xia X H，Liu M，etal.Metabolomics research on focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats’brain treated by musk combined with borneol［J］.J Chin Med Nat，2012，35（8）：1274－9.

［2］ Almeida JR，Souza G R，Silva JC，et al.Borneol，a bicyclic monoterpene alcohol，reduces nociceptive behavior and inflammatory response in mice［J］.Scientific World J，2013，2013：808460.

［3］ Sun X R，Chen L X，Luo H，et al.Volume-activated chloride currents in fetal human nasopharyngeal epithelial cells［J］.J Membr Biol，2012，245（2）：107－15.

［4］ Juhás S，Cikos S，CzikkováS，etal.Effects of borneol and thymoquinone on tnbs-iinduced colitis inmice［J］.Folia Biol（Praha），2008，54（1）：1－7.

［5］ 趙保勝，董淑云，宓穗卿，等.冰片對(duì)腦外傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞INOS表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（5）：590－1.

［5］ Zhao B S，Dong SY，MiSQ，Wang N S.The influence of borneol to the iNOS of brain microvascular endothelial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2002，18（5）：590－1.

［6］ 陳麗新，王立偉 朱林燕，等.Cl－在鼻咽癌細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積回縮中的作用［J］.中國病理生理雜志，2002，18（5）：490－3.

［6］ Chen L X，Wang LW，Zhu L Y，et al.Role of Cl－in regulatory volume decrease of nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Chin J Pathophysiol，2002，18（5）：490－3.

［7］ Chen L X，Zhu L Y，Jacob TJC，Wang LW.Roles of volume-activated Cl－currents and regulatory volume decrease in the cell cycle and proliferation in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Cell Prolif，2007，40（2）：253－67.

［8］ 李 媛，劉善文，李華榮，等.丹參酮ⅡA對(duì)低分化鼻咽癌細(xì)胞氯通道的激活作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（9）：1205－9.

［8］ Li Y，Liu SW，Li H R，et al.Activation of chloride channels by tanshinoneⅡA in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（9）：1205－9.

［9］ 滕雙鳳，劉振鋒，厲冰雪，等.氯通道阻斷劑和白頭翁皂苷的協(xié)同溶血作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（10）：1379－82.

［9］ Teng SF，Liu Z F，Li B X，et al.Synergistic effects of chloride channel blockers on the hemolysis induced by Pulsatilla saponin［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（10）：1379－82.

［10］Chen L X，Wang LW，Zhu l Y，etal.Cell cycle-dependentexpression of volume-activated chloride currents in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2002，283（4）：C1313－23.