黃連生物堿促小鼠睡眠實驗研究

鄒宗堯，王燕枝，胡慭然，夏 爽，王德珍，龐 婕，李學剛，2，3

（1.西南大學藥學院，2.重慶市藥效評價工程技術研究中心，3.重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶 400715）

黃連始載于《神農本草經》，為毛茛科植物黃連（Coptis Chinesis Franch）、三角葉黃連（Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hisao）或云連（Coptis teeta Wall）的干燥根莖。其性味苦、寒，歸心、胃、脾、肝、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功能?！侗静菥V目》明確記載黃連具有治療“孕婦心煩，不能睡眠”的作用；臨床上，黃連常作為治療失眠復方的主藥，如黃連阿膠湯、交泰丸等［1］。主要用于治療心腎不足、陰虛火旺等癥狀，具有靜心、安神的功效，被廣泛用于神經衰弱［2］、失眠等病癥。黃連的活性成分為黃連生物堿，主要為小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿和藥根堿等［3］。目前，關于小檗堿的鎮(zhèn)靜安神和促進睡眠方面的研究工作較多［4－6］，但對黃連其他生物堿在促進睡眠方面的研究卻鮮有報道。本研究在已獲得黃連主要生物堿單體的基礎上［7］，系統(tǒng)比較了5種黃連主要生物堿單體對小鼠睡眠及其神經遞質的影響。

1 材料

1.1 儀器 ZZ-6小鼠自主活動測試儀（成都泰盟科技有限公司）；精密電子天平（德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Direct-Q3超純水系統(tǒng)（德國默克密理博儀器有限公司）；高速勻漿機（美國VWR國際有限公司）；Avanti J-301高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；LC-6AD高效液相色譜儀RF-10AXL熒光檢測器（日本島津公司）。

1.2 試劑與藥品 醋酸鈉、甲醇為色譜純，分別購自阿拉丁和天津市科密歐化學試劑有限公司。其他試劑為分析純，水為超純水；地西泮片（天津力生制藥股份有限公司，批號20120310）；戊巴比妥鈉片（北京化學試劑公司，批號120812）；標準品DA、NE和5-HT（美國Sigma公司，批號分別為1001423402、1001171997、1001344074）；PCPA（東京化成工業(yè)株式會社）；小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿和藥根堿由西南大學藥用資源化學研究所提供。

1.3 動物 SPF級昆明種♀小鼠315只，體質量（20±2）g，購于重慶市中藥研究院實驗動物研究中心，生產許可證號SCXK（渝）2012－0006。自由飲食平衡1周，光照節(jié)律 ∶12 L－12 D（7∶00－19∶00），溫度（20±2）℃，濕度（55±15）%。

2 方法

2.1 分組與給藥 小鼠按體重隨機分為7組：對照組、地西泮組、小檗堿組、黃連堿組、巴馬汀組、表小檗堿組和藥根堿組，每組10只。地西泮組ig 2.25 mg·kg－1·d－1，各黃連生物堿組 ig 75 mg·kg－1·d－1，對照組則灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥5 d。

2.2 自主活動次數測試 末次給藥后，將小鼠放入自主活動儀中，待其適應環(huán)境3 min后，分別記錄其0、1、2、3 h時，小鼠5 min內的自主活動次數。

2.3 閾上劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠實驗 小鼠分組與給藥同“2.1”項。末次給藥1 h后，每只ip閾上劑量的戊巴比妥鈉60 mg· kg－1，給藥容積0.01 ml·g－1。給藥后立刻記時并觀察和記錄小鼠睡眠的潛伏期（從注射戊巴比妥鈉后到小鼠翻正反射消失的時間段）和睡眠期（從翻正反射消失到翻正反射恢復的時間段）［8］。

2.4 閾下劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠實驗 小鼠分組與給藥同“2.1”項。末次給藥1 h后，每只ip給予閾下劑量的戊巴比妥鈉30 mg· kg－1，給藥容積0.01 ml· g－1，觀察并記錄小鼠發(fā)生睡眠只數［9］。

2.5 小鼠腦組織神經遞質的檢測

2.5.1 分組與給藥 分組：小鼠按體重隨機分為7組：對照組、模型組、小檗堿組、黃連堿組、巴馬汀組、表小檗堿組和藥根堿組，每組10只。造模：除對照組ip生理鹽水外，其余各組連續(xù)2 d ip 300 mg·kg－1PCPA。給藥：各黃連生物堿組同“2.1”項，對照組及模型組灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥5 d。

2.5.2 腦組織取材及處理 末次給藥1 h后，將其斷頭處死，迅速在冰盤上剝離出小鼠的下丘腦，并稱重，吸取冰冷的 0.4 mol·L－1的 HClO4，冰浴下勻漿5 min，渦旋2 min，低溫高速離心2次（4℃，14 000 r·min－1，10 min），取上清液經 0.2μm濾膜過濾，作為進樣品。

2.5.3 色譜條件 色譜柱：依利特Hypersil ODS2 C18柱（4.6mm×200mm，5μm）；流動相0.1mol·L－1的醋酸鈉緩沖液（含 0.1 mmol·L－1的 EDTA-2Na，pH 5.1）與色譜甲醇體積比 9∶1，進樣量 20 μl／次，流速 1 ml·min－1，柱溫 30℃，發(fā)射波長 330 nm，激發(fā)波長290 nm。

2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 for Windows軟件進行單因素方差統(tǒng)計分析，多組間比較采用LSD-t檢驗，數據用ˉ±s表示。

3 結果

3.1 對小鼠自主活動的影響 如Tab 1所示，與對照組相比，地西泮組在給藥后1、2、3 h明顯減少小鼠自主活動的站立次數（P＜0.01）。小檗堿組和黃連堿組在給藥后均能降低小鼠活力（P＜0.05）。其余各組在不同的時間段差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.2 對閾上劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠的影響

Fig 1、2所示，與對照組相比，小檗堿組和地西泮組能縮短小鼠睡眠潛伏期，同時明顯延長小鼠的睡眠時間（P＜0.01）。黃連堿組潛伏期縮短了30.0%（P＜0.01），睡眠期延長了 27.9%（P＜0.05）。其余各組的小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間差異無顯著性（P＞0.05）。

Tab 1 Com parison of times of spontaneousmotor activity in juvenilem ice among groups（xˉ±s，n＝10）

Tab 1 Com parison of times of spontaneousmotor activity in juvenilem ice among groups（xˉ±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

Group After administration 0 h 1 h 2 h 3 h Control 64.2±10.5 58.4±9.3 60.5±9.4 65.6±8.2 Diazepam 62.6±11.5 32.6±6.2** 35.3±7.2** 38.3±5.4**Bererine 61.8±9.3 38.7±7.8* 42.3±6.7* 44.9±7.8*Coptisine 63.0±9.7 40.1±9.7* 42.8±8.6* 46.6±9.5*Palmatine 62.5±11.4 65.8±12.5 69.4±8.4 74.7±10.2 Epiberberine 60.2±8.1 59.4±8.9 63.8±11.0 59.2±9.3 Jatrorrhizine 63.7±10.3 60.2±8.1 58.9±7.2 60.3±9.6

Fig 1 Effect of five Coptidis alkaloids period of sleep latency of pentobarbital in suprathreshold dose on juvenilem ice（n＝10）1：Control；2：Diazepam；3：Bererine；4：Coptisine；5：Palmatine；6：Epiberberine；7：Jatrorrhizine.**P＜0.01 vs control.

Fig 2 Effect of five Coptidis alkaloids period of sleeping time of pentobarbital in suprathreshold dose on juvenilem ice（n＝10）1：Control；2：Diazepam；3：Bererine；4：Coptisine；5：Palmatine；6：Epiberberine；7：Jatrorrhizine.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

3.3 對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠的影響Tab 2結果顯示，腹腔注射閾下劑量戊巴比妥鈉的對照組小鼠無翻正反射消失，陽性藥物地西泮組翻正反射行為幾乎全部消失，小檗堿組和黃連堿組的翻正反射消失率明顯增加。提示小檗堿和黃連堿有明顯協(xié)同戊巴比妥鈉促進小鼠睡眠的作用。

Tab 2 Effect of five Coptidis alkaloids on sedative and hypnotic function of pentobarbital sodium with a subthreshold dose in m ice（n＝15）

3.4 對小鼠下丘腦神經遞質含量的影響 Fig 3為3種神經遞質的高效液相色譜圖，此條件下供試品溶液中的各神經遞質和雜峰相互間分離良好［10］。

Fig 3 HPLC graph of three neurotransm ittersA.Standard；B.Sample；1：NE；2：DA；3：5-HT

從Tab 3可知，與對照組相比，模型組的NE和5-HT含量極大減少（P＜0.01）。小檗堿組和黃連堿組的NE明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，小檗堿組和黃連堿組的NE和5-HT含量明顯增加（P＜0.01）；但各組間的 DA含量無差異（P＞0.05）。

Tab 3 Change of the hypothalam ic neurotransm itters content in juvenilem ice among groups（±s，n＝10，ng·g－1）

Tab 3 Change of the hypothalam ic neurotransm itters content in juvenilem ice among groups（±s，n＝10，ng·g－1）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs model

Group NE DA 5-HT Control 1180.25±64.02 252.04±13.64 465.79±26.23 Model 698.34±67.92** 238.67±17.02 231.67±22.54**Bererine 997.18±44.84*＃＃ 266.28±18.75 434.58±24.58＃＃Coptisine 1018.54±77.52*＃＃ 264.13±11.36 402.26±17.09＃＃Palmatine 752.67±89.40 241.97±14.24 201.74±15.31 Epiberberine 714.21±30.56 247.58±13.50 263.47±20.42 Jatrorrhizine 690.98±59.37 267.46±11.45 247.18±15.94

4 討論

黃連的使用在我國擁有悠久的歷史。出自張仲景《傷寒論》的方劑黃連阿膠湯在現代臨床上被廣泛用于治療神經衰弱、失眠［11］等病癥?，F代藥理研究發(fā)現，黃連中小檗堿高劑量時可抑制小鼠大腦皮層興奮過程［12］。據徐錦堂等［13］研究表明，黃連具有中樞抑制作用。本研究結果顯示，5種黃連生物堿中，小檗堿和黃連堿均能明顯減弱小鼠自主活動能力，明顯縮短閾上劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠的潛伏期，延長其睡眠時間，并增加閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠的入睡率，提示小檗堿和黃連堿均具有鎮(zhèn)靜、協(xié)同戊巴比妥鈉促睡眠作用，但黃連堿的藥效作用低于小檗堿。此外，巴馬汀、表小檗堿和藥根堿對小鼠睡眠無明顯作用。

目前研究顯示，下丘腦 －垂體 －腎上腺素（HPA）軸與睡眠相關，可通過HPA軸與DA和5-HT相互作用［14］，來維持相關因子的正常水平，改善睡眠狀態(tài)。在促睡眠的物質基礎研究中發(fā)現，睡眠與NE、DA和5-HT等在內的諸多神經遞質關系密切。DA是促覺醒類的神經遞質，多巴胺能神經元在睡眠－覺醒中起到重要的調節(jié)作用［15］。在神經遞質含量測定中，本研究中各組別之間DA含量差異無統(tǒng)計學意義，因而在下丘腦中DA可能未參與小鼠的睡眠作用。據文獻報道［16］，下丘腦部位直接對睡眠進行調控。在注射了5-HT合成抑制劑 PCPA小鼠的下丘腦中，其5-HT含量明顯減少，HPA軸呈興奮狀態(tài)。各組小鼠的晝夜節(jié)律紊亂，小鼠白晝睡眠行為幾乎消失，表明PCPA小鼠失眠模型造模成功?，F代藥理研究表明，5-HT增多與促睡眠有關［17］。文獻報道，大鼠下丘腦視前區(qū)5-HT含量增加可引起中樞性疲勞，并促進睡眠，而NE主要以興奮中樞和覺醒功能為主，兩者之間存在相互抑制作用［18－19］。本研究結果顯示，小檗堿組和黃連堿組的NE和5-HT與模型組相比明顯升高（P＜0.01），其HPA軸受到抑制，5-HT與對照組相比無差異（P＞0.05），但 NE的含量低于對照組（P＜0.05），即在給予受試藥物后，小鼠下丘腦中5-HT含量的升高相對抑制了NE含量恢復到正常水平，符合文獻報道。綜上所述，黃連生物堿中小檗堿和黃連堿可能通過抑制HPA軸，增加PCPA小鼠失眠模型下丘腦中5-HT和NE的含量，來發(fā)揮一定的鎮(zhèn)靜、催眠的作用。5種黃連生物堿中，小檗堿促小鼠睡眠作用強于黃連堿，而表小檗堿、藥根堿和巴馬汀對小鼠睡眠無明顯影響。

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