高砷沉積物中砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的微生物作用機制

董國文 ，陳一平,2，陳 飄 ,2，張麗華

（1.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院 福建 三明 365004；2.福建農(nóng)林大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，福建，福州 350002）

砷的生物地球化學(xué)調(diào)查表明自然環(huán)境中微生物在砷的化學(xué)形態(tài)及循環(huán)方面起到至關(guān)重要的作用[1-2]。過程控制砷釋放到地下水系統(tǒng)很復(fù)雜并且已經(jīng)進行了廣泛的研究，但仍然還存在強烈的爭論。已有幾個微環(huán)境實驗研究表明土著金屬還原微生物(例如Geobacteraceae)在砷釋放到地下含水層中起到關(guān)鍵作用[3-7]。但有關(guān)這些土著微生物群落在砷遷移轉(zhuǎn)化過程中的詳細作用還沒有特別描述。而可溶的自然小分子有機酸是土壤中不穩(wěn)定的碳源之一，其中，乙酸一旦釋放到土壤溶液中可能被土壤微生物利用，加速金屬礦物的風(fēng)化。淹水能改變土壤氧化還原電位引起土壤短暫缺氧，吸附到鐵氧化物顆粒的砷很容易通過鐵或砷還原微生物的活動而溶解。因此，在環(huán)境條件改變下土著微生物活動對沉積物中砷移動的重要性值得深入研究。特別是對環(huán)境中不可培養(yǎng)的砷代謝微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)進行進一步的研究，以確定其在砷遷移轉(zhuǎn)化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品采集

本試驗供試沉積物采自湖南省石門縣雄黃礦廢棄礦區(qū)附近。樣品采集后密封保存于4°C冰箱備用。

1.2 實驗設(shè)計

實驗所用沉積物其有效態(tài)砷含量在34.15 mg·kg-1，沉積物樣品厭氧培育采用105 mL血清瓶預(yù)先滅菌處理，然后添加（20±1）g沉積物，加入24 mL無菌水或溶液。液面下氮吹30 min，液面上氮吹30 min，然后蓋上灰色丁基橡膠塞，用卡口鉗將鋁皮密閉，30°C暗處培養(yǎng)。沉積物中主要添加乙酸鈉和Fe(III)[8]，處理方式見表1。

1.3 分析方法

樣品中As(Ⅲ)的濃度采用氫化物發(fā)生原子熒光法(AF-610B北京瑞利)測定[9]，總砷采用ICP-MS（安捷倫7700X）測試。Fe(Ⅱ)的濃度采用Ferrozine法來測定(TU1900，北京普析)[10]。樣品中CO2用10 μL微量進樣器取樣，濃度采用氣相色譜測試(GC-960，上海海欣)。測試條件為柱溫50℃，熱導(dǎo)檢測，載氣為氬氣。

沉積物樣品總DNA的提取純化按照Fast DNA Spin Kit for soil(MP Biomedical USA)的操作說明進行。對砷的異化還原微生物進行PCR擴增，方法是采用nested PCR，先用引物F8和RGeobacteraceae-825進行擴增[11-12]，目的片段在800 bp左右，產(chǎn)物割膠純化后再PCR，引物用Bacteria specific primers F357GC和R518[13]，PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用DGGE（變性梯度凝膠電泳）電泳儀系統(tǒng)(DcodeTM，Biorad)分離PCR產(chǎn)物，并克隆測序（上海生工）。分別采用Geobacteraceae特異引物F494-R825[14]和 As(Ⅴ)異化還原菌功能基因引物arrAF4-arrAR4[15]進行real-time PCR(ABI Step One Plus)來分析沉積物中Fe(Ⅲ)和As(Ⅴ)還原菌的相對豐度。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧環(huán)境微生物對沉積物中砷的釋放

本實驗以尾礦區(qū)附近高砷沉積物作為研究對象，在厭氧微環(huán)境條件下，考察外加有機碳源乙酸鈉、可溶的Fe(Ⅲ)和不溶的Fe(Ⅲ)對沉積物中微生物釋放砷的影響，結(jié)果見圖1。在厭氧環(huán)境下，與無菌控制樣品相比，沉積物中砷的遷移主要是微生物的作用。滅菌樣品中砷的釋放相對較少，說明礦物表面解吸不是主要的因素。沉積物中添加乙酸鈉和同時添加乙酸鈉及可溶Fe(Ⅲ)后，釋放到水體中的砷濃度分別為59.84，61.36 mg·L-1，且主要是 As(Ⅲ)(＞90%)。從砷隨著時間釋放的曲線來看，培育前期加入可溶的Fe(Ⅲ)會減少砷的釋放，后期會增加砷的釋放，但主要影響砷釋放的還是乙酸鈉的貢獻。只加水的樣品中也有一定砷的釋放，說明土著厭氧微生物還可以利用沉積物本身的有機碳源進行呼吸代謝。而加入Fe(OOH)膠體的樣品釋放到水體的砷幾乎可以忽略，說明Fe(OOH)膠體對微生物釋放到水體中的砷有吸附作用，從滅菌控制樣品中也可以看出（見圖2），加入Fe(OOH)膠體的樣品中釋放到水體中的砷的濃度比其它樣品明顯低。

從圖3可以看出，厭氧環(huán)境下沉積物中釋放砷的同時還有鐵的釋放，但鐵的釋放比砷要慢，但Fe(Ⅲ)一直都有被還原，不管是加入可溶的還是不溶的Fe(Ⅲ)，都能促進微生物還原Fe(Ⅲ)。

圖1 厭氧條件下微生物對沉積物中砷的釋放

圖 2 厭氧條件下沉積物中砷的釋放(非生物作用)

圖 3 厭氧條件下微生物對沉積物中Fe(II)的釋放

2.2 厭氧環(huán)境微生物對沉積物中有機碳的轉(zhuǎn)化

根據(jù)圖4可知，在厭氧環(huán)境下，外源的有機碳源乙酸鈉和Fe(Ⅲ)都能夠促進沉積物中土著微生物的活性。以有機物作為電子供體產(chǎn)生CO2的貢獻大小依次為NaAc+Fe(Ⅲ)＞Fe(OOH)＞NaAc＞H2O。從有機碳的轉(zhuǎn)化可以看出，加入可溶的或不溶的Fe(Ⅲ)后，CO2的濃度顯著增加，說明Fe(Ⅲ)的加入促進了鐵還原微生物的生長，異化鐵還原明顯加強，同時也說明沉積物中鐵還原菌非常豐富。

2.3 沉積物中功能性微生物分析

在厭氧環(huán)境下沉積物中鐵的呼吸代謝通常與Geobacteraceae科微生物活動相關(guān)[12,16]。故采用特異引物F8和RGeobacteraceae-825對鐵還原微生物進行PCR-DGGE分析。測序結(jié)果見表2。在厭氧環(huán)境下，沉積物中有22個優(yōu)勢菌種，大部分屬于δ變形菌門，主要是Geobacter(地桿菌屬)，另外兩個分別屬于Chloroflexi(綠彎菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)。典型鐵還原菌Geobacteraceae在沉積物中豐富，其中大部分優(yōu)勢種群與有機碳的轉(zhuǎn)化和Fe(Ⅲ)還原相關(guān)[17-23]。

圖4 不同處理對沉積物中CO2產(chǎn)生量的影響

表2 測序序列比對結(jié)果

沉積物中提供電子供體和電子受體對異化金屬還原有重要影響。鐵還原菌(IRB)作用下的異化鐵還原反應(yīng)對于控制沉積物中砷污染有重要意義，因此很多研究都對IRB在這個過程中的作用進行了探討?；谇懊嫜芯堪l(fā)現(xiàn)厭氧條件下釋放出來的砷的量要大于鐵的量，有研究表明，砷吸附于飽和水鐵礦，溶解1 mol Fe只能釋放0.16 mol砷[24]。同時二價鐵含量較低，由此推測礦區(qū)沉積物中可能還有能夠直接還原As(Ⅴ)的微生物。所以分別考察了有機碳和Fe(Ⅲ)在厭氧條件下對沉積物中 Fe(Ⅲ)和 As(Ⅴ)還原微生物豐度的影響，以獲得沉積物中砷釋放的直接證據(jù)，結(jié)果見圖5。

圖 5不同處理下礦區(qū)沉積物中Geobacteraceae科微生物拷貝數(shù)

由圖5可知，添加Fe(OOH)后，樣品中Geobacteraceae科微生物拷貝數(shù)上升最多，加入乙酸鈉后，樣品中Geobacteraceae科微生物拷貝數(shù)也有增加，但沒有加入Fe(OOH)多。說明三價鐵作為電子供體對樣品中Geobacteraceae科微生物富集的影響更明顯。通過DGGE分析也發(fā)現(xiàn)添加Fe(OOH)后礦區(qū)沉積物中Geobacteraceae科微生物種類更多。這可能是由于鐵膠顆粒較小，有些可能都是納米級的，納米顆粒的鐵氧化物能促進微生物對鐵的異化還原[25]，所以加入鐵膠后促進沉積物中異化鐵微生物的生長。但正是由于鐵膠顆粒小，比表面積大，使得鐵膠對砷有很強的吸附作用，所以遷移到水體的砷很少。鐵膠雖然在生物方面有促進鐵還原的作用，但非生物的物理吸附也不可忽視?？傊尤肴齼r鐵和乙酸鈉后，對Geobacteraceae科微生物生長有明顯促進作用，也再次證實Geobacteraceae科微生物活動對沉積物中砷的釋放有重要影響。

通過砷的遷移轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，砷遷移出來的最高濃度為61.4 mg·L-1，換算遷移的量為73.7 mg·kg-1。而厭氧環(huán)境下鐵最高遷移量是37.4 mg·kg-1。根據(jù)鐵砷溶解釋放比例(molar ratio As/Fe=0.16)折算，由于鐵溶解釋放砷的量只有8.0 mg·kg-1，遠低于砷釋放的總量，當(dāng)然還有其他金屬氧化物還原而引起砷的釋放，例如錳氧化物。不過金屬氧化物還原引起的砷的釋放主要還是鐵錳氧化物，因此推測此礦區(qū)沉積中砷的釋放還存在其它關(guān)鍵釋放機制，例如能夠直接還原As(Ⅴ)的微生物。16s rRNA被廣泛應(yīng)用于對微生物多樣性的檢測。然而在微生物生態(tài)學(xué)中，物種鑒別并不一定與新陳代謝有關(guān)。另一種研究微生物活動的方法就是找尋功能基因。例如對硫還原菌(SRB)來說，大多數(shù)研究都致力于DSR片段的研究，這一成就被用于SRB在耐鹽環(huán)境中的鑒別。同樣的研究發(fā)現(xiàn)arrA功能基因是異化砷酸鹽微生物(DARPs)還原As(V)可靠的標(biāo)志[26]，因此利用功能基因引物arrAF4-arrAR4進行了PCR擴增，并對沉積物中異化砷酸鹽的微生物豐度進行了熒光定量PCR分析，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，添加乙酸鈉后，沉積物中DARPs功能基因arrA拷貝數(shù)顯著增加，而加入三價鐵后略有增加，說明乙酸鈉主要是富集DARPs。與前面熒光定量PCR分析Geobacteraceae科微生物相比，DARPs功能基因arrA拷貝數(shù)要高出一到兩個數(shù)量級，說明DARPs相對豐度更高，意味著DARPs對礦區(qū)沉積物中砷的釋放貢獻更大。也就是說沉積物中除了Geobacteraceae科微生物對砷的遷移轉(zhuǎn)化起作用外，起主要作用的微生物還有DARPs。陳錚等在研究幾種含有醌類結(jié)構(gòu)的電子中介體對沉積物中砷/鐵遷移時發(fā)現(xiàn)，沉積物中砷/鐵遷移到水體中主要是金屬還原菌的作用，外源載體表面所含有的醌類結(jié)構(gòu)及導(dǎo)電性是影響微生物胞外電子傳遞與砷/鐵形態(tài)轉(zhuǎn)化關(guān)系的重要原因[27]。

沉積物中砷釋放機制既包括含砷鐵氧化物的還原溶解[4]，還包括吸附的 As(Ⅴ)直接還原為 As(Ⅲ)。As(Ⅴ)的微生物還原機制主要分成兩類：解毒和異化還原。As(Ⅴ)，由于結(jié)構(gòu)類似磷，很容易通過磷的攝取蛋白進入細胞。微生物已經(jīng)發(fā)展了一種解毒策略來保護自己免受As(Ⅴ)的毒害。例如，在有氧和厭氧環(huán)境下通過砷的耐受系統(tǒng)(ars)將 As(Ⅴ)還原為 As(Ⅲ)。有些厭氧微生物通過耦合As(Ⅴ)的還原和氧化有機碳獲得能量。這些異化砷還原微生物在呼吸過程中以As(Ⅴ)作為最終電子受體。微生物還原砷能夠增加砷的移動，因為As(Ⅲ)的移動能力比As(Ⅴ)更強。

圖6 不同處理下礦區(qū)沉積物中砷arrA功能基因拷貝數(shù)

3 結(jié)論

本文在厭氧環(huán)境下，添加乙酸鈉和Fe(Ⅲ)后微生物對沉積物中砷釋放的影響，獲得以下主要結(jié)論：

(1)礦區(qū)沉積物中砷的釋放主要是微生物的作用，并伴隨鐵的釋放；

(2)在厭氧微環(huán)境下，添加乙酸鈉后，主要以As(Ⅲ)的形式釋放到水體中，F(xiàn)e(OOH)對砷有吸附作用；

(3)乙酸鈉和三價鐵對沉積物中的微生物都有明顯富集作用，其中乙酸鈉主要促進DARPs的生長，F(xiàn)e(OOH)主要促進Geobacteraceae科微生物的生長；

(4)厭氧環(huán)境下沉積物中砷的釋放是鐵還原菌Geobacteraceae和砷還原菌DARPs共同作用的結(jié)果，其中DARPs起關(guān)鍵作用；

(5)在礦區(qū)沉積物中，富集的微生物中優(yōu)勢種屬主要是由δ變形菌門、Chloroflexi(綠彎菌門)和Firmicutes(厚壁菌門)所控制。