脂多糖對(duì)裸鼴鼠肺臟組織影響的初探

張成財(cái)，劉尹航，陳 超，江文正

（1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，上海 200433；2. 上海外國語大學(xué)附屬中學(xué)，上海 200083；3. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241）

裸鼴鼠屬于哺乳綱嚙齒目裸鼴鼠屬裸鼴鼠種，原產(chǎn)于非洲，主要以植物的根莖為食[1-2]。裸鼴鼠長期生活在地下2m左右的洞穴中，依靠身體上的觸毛感受周圍的環(huán)境。裸鼴鼠因具有對(duì)癌癥的免疫能力等生物學(xué)特性，近年來越來越受到科研工作者關(guān)注[3]。

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是除心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素所致的急性進(jìn)行性呼吸功能衰竭[4]，多見于嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷等疾病的發(fā)生過程中，表現(xiàn)為以中性粒細(xì)胞為主的肺泡炎性細(xì)胞浸潤、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮損傷導(dǎo)致的彌漫性肺水腫[5-6]。盡管現(xiàn)代醫(yī)療水平已經(jīng)取得長足進(jìn)步，然而急性呼吸窘迫綜合征的病死率仍高達(dá)40%～68.5%[7-9]。因此，尋找更加有效的急性肺損傷治療方法具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)初步探討腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)裸鼴鼠肺臟組織的影響，為進(jìn)一步研究其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12月齡健康雄性裸鼴鼠10只，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK（滬）2017-0004]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)處理

10只裸鼴鼠隨機(jī)分為對(duì)照組5只和實(shí)驗(yàn)組5只。實(shí)驗(yàn)前12 h裸鼴鼠禁食不禁水，稱質(zhì)量后實(shí)驗(yàn)組按體質(zhì)量以10 mg/kg給藥量腹腔注射LPS，對(duì)照組注射等體積的0.9%NaCl溶液（生理鹽水）。

1.3 主要儀器設(shè)備及試劑

流式細(xì)胞儀購自美國Beckeman公司；烘箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；自動(dòng)組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、染色機(jī)、封片機(jī)和倒置熒光顯微鏡等均購自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；活性氧檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司；LPS購自美國Sigma公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

腹腔注射LPS 6 h后，按體質(zhì)量以50 mg/kg給藥量，腹腔注射0.375%戊巴比妥鈉，麻醉處死裸鼴鼠。

1.4.1 肺臟組織切片的制備與觀察 打開胸腔，取肺臟右側(cè)下葉，置于通用型中性組織固定液中固定24 h。經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、染色、封固等步驟完成HE染色組織切片的制備，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.2 肺組織濕干重比的測(cè)定 打開胸腔，取出肺臟左側(cè)。PBS緩沖液沖洗干凈，并用濾紙吸干。左肺置于電子天平稱質(zhì)量，計(jì)作濕質(zhì)量。置于烘箱（80℃，48h）烤至質(zhì)量恒定，稱量后計(jì)為干質(zhì)量。計(jì)算肺濕干質(zhì)量比（=濕質(zhì)量/干質(zhì)量）。

1.4.3 肺組織細(xì)胞活性氧含量與凋亡檢測(cè) 取右側(cè)肺臟上葉和中葉，在超凈臺(tái)研磨提取細(xì)胞。用直徑為70 μm的細(xì)胞篩濾過后，加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。按照說明書方法添加檢測(cè)試劑，流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺組織細(xì)胞活性氧含量（以平均熒光值表示）和凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì)裸鼴鼠肺組織濕干質(zhì)量比的影響

與對(duì)照組（n=5）肺組織濕干質(zhì)量比（5.10±0.20）比較，實(shí)驗(yàn)組（n=5）肺組織濕干質(zhì)量比（5.04±0.14）未發(fā)生顯著變化（P＜0.05）。

2.2 LPS對(duì)裸鼴鼠肺組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組（n=5）肺組織細(xì)胞活性氧含量（19 913±4 700）比較，實(shí)驗(yàn)組（n=5）肺組織細(xì)胞活性氧含量（35325±2 989）顯著升高（P＜0.05)。

2.3 LPS對(duì)裸鼴鼠肺組織細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組肺組織細(xì)胞早期凋亡率未發(fā)生明顯變化，晚期凋亡率顯著升高（P＜0.01，圖1）。

2.4 LPS對(duì)裸鼴鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡觀察顯示，對(duì)照組（圖2A）和實(shí)驗(yàn)組（圖2B）肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡孔內(nèi)無明顯滲出液和炎性細(xì)胞浸潤。

圖 1 裸鼴鼠肺組織細(xì)胞凋亡率Figure 1 Apoptosis rate of lung tissue cells in naked mole rats

圖 2 裸鼴鼠肺組織病理學(xué)觀察Figure 2 Pathological observation on lung tissues in naked mole rats

3 討論

目前臨床常見的感染以革蘭陰性桿菌多見，其主要致病原是內(nèi)毒素（endotoxin，ET），而LPS是內(nèi)毒素的主要成分，故現(xiàn)在已不再區(qū)分LPS和ET[10-11]。有研究表明，腹腔注射一定劑量的LPS能夠引起急性肺損傷[12]。急性肺損傷大致可以分為急性滲出期、亞急性纖維增殖期和慢性纖維化應(yīng)答期[13]。急性滲出期主要表現(xiàn)為高通透性肺泡水腫、出血和血栓形成，影響通氣血流比值和肺泡換氣，表現(xiàn)為急性低氧血癥[14-15]。主要病理改變?yōu)檠仔苑磻?yīng)和凝血反應(yīng)，導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞損傷，以及肺泡毛細(xì)血管膜屏障功能完整性的破壞[16]。機(jī)體在受到LPS刺激時(shí)，先產(chǎn)生非特異性免疫應(yīng)答，主要通過循環(huán)和組織炎性細(xì)胞介導(dǎo)完成。這些炎性細(xì)胞在正常時(shí)沒有活性，當(dāng)受到病原刺激時(shí)，可以被快速激活，并通過產(chǎn)生炎性介質(zhì)和活性氧等引起組織損傷[17]。

裸鼴鼠在自然狀態(tài)下生活于封閉的地下洞道，不易與外界進(jìn)行氣體交換，致使洞道內(nèi)長期維持低氧及高二氧化碳的氣體環(huán)境[18-19]，在長期進(jìn)化過程中，裸鼴鼠已經(jīng)產(chǎn)生了一系列生理改變以適應(yīng)這種氣體環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)給裸鼴鼠腹腔注射LPS，肺組織濕干質(zhì)量比未發(fā)生顯著變化，表明裸鼴鼠并沒有發(fā)生急性肺損傷，病理學(xué)觀察也驗(yàn)證了此結(jié)論；裸鼴鼠肺組織內(nèi)活性氧含量顯著升高，但是肺組織并未受到損傷，提示裸鼴鼠體內(nèi)可能存在未發(fā)現(xiàn)的抗損傷機(jī)制；肺組織細(xì)胞晚期凋亡率顯著升高，但是早期凋亡比例沒有發(fā)生顯著變化，這可能是由于裸鼴鼠肺臟組織中存在強(qiáng)大的細(xì)胞儲(chǔ)備，在機(jī)體遭受損傷時(shí)，能夠快速動(dòng)員儲(chǔ)備細(xì)胞，維持機(jī)體健康。

綜上所述，雖然受LPS干預(yù)的裸鼴鼠肺臟組織中活性氧含量與晚期凋亡率顯著升高，但是肺組織濕干質(zhì)量比和肺組織細(xì)胞早期凋亡率并未發(fā)生顯著變化，病理學(xué)觀察也未見相應(yīng)病變。結(jié)果表明，裸鼴鼠對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷有一定程度耐受，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。