兔“有機(jī)磷酸酯類中毒及解救”實(shí)驗(yàn)中乙酰膽堿酯酶活力測定技術(shù)的改進(jìn)

王秋靜，宋祥福，李天舒

（1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130021；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 130021）

藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)“有機(jī)磷酸酯類中毒與解救”作為傳統(tǒng)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中有著重要意義，是醫(yī)學(xué)生必做的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中可以觀察到機(jī)體從正常生理狀態(tài)到有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥中毒的病理變化，以及藥物對(duì)中毒解救治療效果的整個(gè)過程。臨床上乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活力測定是對(duì)急性有機(jī)磷中毒患者進(jìn)行早期診斷、判斷療效和預(yù)后的重要指標(biāo)，對(duì)治療具有指導(dǎo)意義[1]。所以，AChE活力測定實(shí)驗(yàn)是臨床專業(yè)醫(yī)學(xué)生需要重點(diǎn)掌握的內(nèi)容。

傳統(tǒng)的AChE活力測定是采用羥胺三氯化鐵法，涉及氫氧化鈉、鹽酸和三氯化鐵（加濃鹽酸配制）等危險(xiǎn)化學(xué)試劑，且堿性羥胺溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，水浴時(shí)間長，測定AChE時(shí)效率較低，容易產(chǎn)生沉淀等缺陷。因此，尋求一種檢測準(zhǔn)確，操作時(shí)間短，既能保障實(shí)驗(yàn)室生物安全，又有利于實(shí)驗(yàn)教學(xué)長期應(yīng)用的AChE活力測定方法相當(dāng)重要。此外，原“有機(jī)磷酸脂類中毒及解救”實(shí)驗(yàn)中使用的醫(yī)用藥品硫酸阿托品和碘解磷定現(xiàn)在屬于臨床嚴(yán)控處方針劑，較難購得，故急需找到適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的替代藥品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥品

新西蘭兔16只，雌雄不限，3～4月齡，體質(zhì)量2.3 ～2.5 kg，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(吉)2016-0004]，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(吉) 2017-0003]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和處理嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利3R原則和吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)相關(guān)條例要求。硫酸阿托品注射液購自山西省芮城科龍獸藥有限公司（批號(hào)：20170512）；碘解磷定注射液購自哈爾濱市宏達(dá)動(dòng)物藥品廠（農(nóng)業(yè)部獸藥GMP驗(yàn)收通過企業(yè)）（批號(hào)：20161109）；敵百蟲購自湖北沙隆達(dá)股份有限公司（批號(hào)：20170413）。

1.2 AChE測定實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法改進(jìn)

依據(jù)測定全血AChE活性的分光光度測定方法（硫代乙酰膽堿-聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸法，WS/T67-1996）[2]，原理是AChE水解硫代乙酰膽堿（ASCh）生成硫代膽堿和乙酸，硫代膽堿與硫基顯色劑（DTNB）反應(yīng)形成黃色化合物（TNB），在波長412 nm 處比色定量。通過水解產(chǎn)物膽堿的測定量反映AChE的活力。

本研究在參照硫代乙酰膽堿-聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸法的基礎(chǔ)上，對(duì)部分實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法和條件進(jìn)行改良：由于抑制劑柳酸毒扁膽堿為嚴(yán)格管制藥品，本研究采用原實(shí)驗(yàn)室?guī)齑娴乃畻钏岫颈鈮A代替，以降低實(shí)驗(yàn)成本；ASCh生物試劑目前在市場上難以購買到，故用碘化硫代乙酰膽堿代替且加樣前37℃水??；由于有機(jī)磷中毒后血管收縮，通過耳緣靜脈采取末梢血非常困難，且極易造成溶血，而動(dòng)脈血不易凝固，故通過頸總動(dòng)脈插管取血可迅速獲得足量符合測定要求的全血。此外，AChE 抑制法通常使用比色管分光光度法測定，這在一定程度上制約了其進(jìn)行多次重復(fù)，也不利于實(shí)現(xiàn)高通量操作，而且需要消耗大量的試劑藥品[3]。而微孔板法則具有可高通量操作、易于多次重復(fù)、所需試樣體積少等特點(diǎn)[4]。因此，本研究用微孔板法代替比色管分光光度法測定樣本吸光度值。經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳操作流程，其優(yōu)點(diǎn)包括水浴時(shí)間短、操作安全、實(shí)驗(yàn)成本低、靈敏度及時(shí)效率高。改進(jìn)后和傳統(tǒng)AChE活力測定方法的操作流程分別見表1和表2。

表 1 改進(jìn)后AChE活力測定方法操作流程Table 1 Operation flow of improved AChE activity determination method(mL)

表 2 傳統(tǒng) AChE活力測定方法操作流程Table 2 Operation process of traditional AChE activity determination method(mL)

1.3 尋找替換原實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的臨床嚴(yán)控處方藥品

本研究以獸用針劑硫酸阿托品和碘解磷定代替醫(yī)用處方藥，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出兩種藥品的給藥劑量分別為：0.05%阿托品2 mL/kg；2.5%碘解磷定4mL/kg。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)效果良好，可達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期目的，匹配教學(xué)需要，使經(jīng)典實(shí)驗(yàn)得以延續(xù)，保障該實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目長期順利進(jìn)行。

1.4 改進(jìn)后和傳統(tǒng)方法測定 AChE活力

將16只家兔隨機(jī)分成2組，分別為改進(jìn)后組和傳統(tǒng)組，每組8只，測定AChE活力。稱質(zhì)量，觀察并記錄各組家兔的活動(dòng)情況：呼吸、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌張力及有無肌震顫等。之后進(jìn)行氣管插管和頸總動(dòng)脈插管術(shù)，連接呼吸、血壓換能器和心電導(dǎo)線，記錄中毒前后及給予解救藥后血壓、呼吸、心電、心率等指標(biāo)變化，同時(shí)進(jìn)行頸總動(dòng)脈插管以備取血。設(shè)定家兔在給藥前、中毒癥狀明顯時(shí)、給予阿托品待癥狀明顯緩解后，以及給予解磷定解救后0、10、20和30 min共7個(gè)取血時(shí)間點(diǎn)測定AChE活力。

取正常血后，按體質(zhì)量經(jīng)家兔耳緣靜脈注射10%敵百蟲1 mL/kg。按前述指標(biāo)觀察并記錄中毒癥狀。待中毒癥狀明顯時(shí)取血，取血結(jié)束后立即靜脈注射0.05%硫酸阿托品2 mL/kg，記錄中毒癥狀有何改變并取血，而后靜脈注射2.5%碘解磷定4 mL/kg，并在給予解磷定解救后0 min、10 min、20 min、30 min取血，同時(shí)觀察、比較給予阿托品和解磷定后，家兔呼吸、瞳孔大小、唾液分泌等中毒癥狀。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

用改進(jìn)后和傳統(tǒng)方法測定AChE活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的AChE活力測定值與時(shí)間均呈正相關(guān)關(guān)系；改進(jìn)后方法在給藥后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的AChE活力測定值均比傳統(tǒng)方法高（P＜0.05）（表3）。結(jié)果說明，改進(jìn)后的測定結(jié)果與傳統(tǒng)一致，改進(jìn)后方法比傳統(tǒng)方法測定AChE活力的靈敏度和時(shí)效率高，而且準(zhǔn)確性及可靠性略佳，主要體現(xiàn)在中毒時(shí)最低檢測活力上。

表 3 兔給藥前、中毒及給予解救藥后AChE活力Table 3 AChE activity of rabbits before administration, poisoning and after administration of rescue drugs(，U/mL)

表 3 兔給藥前、中毒及給予解救藥后AChE活力Table 3 AChE activity of rabbits before administration, poisoning and after administration of rescue drugs(，U/mL)

注：與傳統(tǒng)方法比較，*P<0.05。

組別 n 給藥前 中毒期間 給阿托品后 給解磷定后0 min 10 min 20 min 30 min傳統(tǒng)改進(jìn)后8 8 8.25±1.05 7.55±0.85 0.45±0.05 1.74±0.13*0.55±0.04 2.25±0.25*3.95±0.35 6.55±0.55*5.05±0.46 6.91±0.52*5.52±0.50 6.78±0.61*4.65±0.43 5.89±0.49*

3 討論

有機(jī)磷酸酯類為持久性抗AChE劑，進(jìn)入機(jī)體后，能與AChE結(jié)合，并使后者失去水解乙酰膽堿的能力，導(dǎo)致乙酰膽堿在體內(nèi)大量堆積，進(jìn)而激動(dòng)M 和N 受體并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生M、N 樣及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀?？鼓憠A藥阿托品能解除有機(jī)磷中毒的M樣癥狀，而解磷定可復(fù)活A(yù)ChE水解乙酰膽堿的能力，對(duì)M、N 樣癥狀均有效。

本研究通過改進(jìn)“有機(jī)磷酸酯類中毒與解救”實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，摸索出一種檢測準(zhǔn)確、用時(shí)短（提高課堂利用率）、操作安全、靈敏度和時(shí)效率高，且教學(xué)成本合理的AChE活性測定方法；尋找到能替換原實(shí)驗(yàn)方法中應(yīng)用的臨床嚴(yán)控處方藥品，使與臨床密切相關(guān)的藥理學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)得以順利延續(xù)；同時(shí)開發(fā)和應(yīng)用先進(jìn)儀器，創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)?zāi)K，在原有簡單定性實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充了對(duì)臨床中毒診斷常用的心電、血壓和呼吸流量等定量指標(biāo)檢測[5]，進(jìn)一步完善了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。這有利于醫(yī)學(xué)生應(yīng)用先進(jìn)儀器，客觀、準(zhǔn)確、綜合地了解“有機(jī)磷酸酯類中毒及解救”實(shí)驗(yàn)的發(fā)病機(jī)制和解救藥物的藥效機(jī)制，并在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中結(jié)合臨床檢查項(xiàng)目和用藥情況，充分利用基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課的作用，培養(yǎng)學(xué)生臨床實(shí)際應(yīng)用能力[6]。