60Co γ射線輻射對(duì)裸鼴鼠腎臟、肺臟以及骨骼肌的影響

張靜遠(yuǎn)，張倩倩，趙懿寧，楊 蓉，張成財(cái) ，賀辰囧，袁 征，崔淑芳#

（1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，上海 200433；2. 上海市楊浦區(qū)精神衛(wèi)生中心醫(yī)技科，上海 200090；3. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071）

裸鼴鼠（naked mole rat）屬于哺乳綱嚙齒目豪豬亞目濱鼠科裸鼴鼠屬裸鼴鼠種，原產(chǎn)于非洲，以植物的根莖為食[1-2]。裸鼴鼠長期生活在地下2m的洞穴中，視力幾乎喪失，依靠身體與嘴兩側(cè)的觸毛感受周圍的環(huán)境。裸鼴鼠具有抗腫瘤、抗衰老、耐低氧及耐疼痛等特性，近年來已引起各國科研工作者的廣泛關(guān)注[3]。

電離輻射對(duì)生物體的影響是目前生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。研究顯示，輻射能夠引發(fā)生物體多個(gè)組織的損傷，如γ射線輻射后ICR小鼠出現(xiàn)骨髓鐵沉積現(xiàn)象[4]；BALB/c小鼠胸腔輻射模擬可導(dǎo)致肺臟功能細(xì)胞大量壞死，肺臟嚴(yán)重纖維化[5]；7 Gy輻射C57BL/6J小鼠后，誘發(fā)原發(fā)性結(jié)腸炎癥及嚴(yán)重的功能障礙[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠在活體水平具有天然的輻射耐受能力[7]，腎臟、肺臟和骨骼肌作為機(jī)體內(nèi)的重要器官和組織，在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以裸鼴鼠為研究對(duì)象，檢測輻射后腎臟、肺臟和骨骼肌的組織學(xué)變化，以及氧化應(yīng)激指標(biāo)變化，初步探討輻射對(duì)裸鼴鼠的影響，以期為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18月齡健康雄性裸鼴鼠21只，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK（滬）2017-0004]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)處理

21只裸鼴鼠隨機(jī)分為2組，分別為對(duì)照組7只和實(shí)驗(yàn)組14只。實(shí)驗(yàn)組裸鼴鼠給予全身一次性60Co γ射線輻射，輻射劑量率為1.163 Gy/min，輻射時(shí)間為8.6 min，總輻射劑量為10 Gy，由海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心完成。

1.3 主要儀器設(shè)備及試劑

自動(dòng)組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、染色機(jī)、封片機(jī)和倒置熒光顯微鏡等均購自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司。生化檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 腎臟、肺臟和骨骼肌組織切片的制備與觀察 分別取對(duì)照組、輻射后7 d和14 d實(shí)驗(yàn)組各3只裸鼴鼠，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉，迅速取下腓腸肌，打開腹腔，取出腎臟、肺臟，置于通用型中性組織固定液中固定24 h。經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、染色、封固等步驟完成HE染色組織切片的制備，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.2 腎臟、肺臟和骨骼肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 分別取對(duì)照組、輻射后7 d和14 d實(shí)驗(yàn)組各4只裸鼴鼠，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉，迅速取下腓腸肌，打開腹腔，取出腎臟、肺臟。剪取0.1 g組織制備勻漿，經(jīng)40 μm孔徑篩網(wǎng)研磨過濾后加入1 mL裂解液，12 000×g，4℃離心10min，取上清液用于檢測丙二醛（maleicdialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量，檢測步驟參照試劑盒說明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。各實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以x-±s表示，使用Graphpad Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。多組比較先進(jìn)行方差分析，再采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

2.1.1 腎臟 光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組腎臟細(xì)胞清晰完好，腎小球未見病變，基底膜完整（圖1A）。輻射后7 d及14d，鏡下可見腎臟細(xì)胞大小正常，未出現(xiàn)炎性反應(yīng)和明顯的水腫、壞死等病變（圖1B、C）。

2.1.2 肺臟 光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組裸鼴鼠肺臟組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡大小正常（圖1D）。輻射后未出現(xiàn)肺泡腔滲出液和出血、成纖維細(xì)胞增生、肺組織局灶性實(shí)變等病變，但偶見肺泡間隔輕微增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤（圖1E、F）。

2.1.3 骨骼肌 光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組裸鼴鼠骨骼肌形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肌纖維呈細(xì)條狀整齊平行排列（圖1G）。輻射后肌纖維呈圓形或多邊形，細(xì)胞核位于周邊；肌纖維相互平行排列，聚集成束，其周圍包有結(jié)締組織，即肌束膜；大小不等的肌束聚集在一起構(gòu)成肌肉，其周圍包有致密的結(jié)締組織，即肌外膜；均未見肌纖維萎縮、壞死或者纖維化（圖1H、I）。

2.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

2.2.1 腎臟 腎臟組織中MDA含量在輻射后7 d明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），輻射后14d較對(duì)照組、輻射后7d有明顯升高（P＜0.01）。T-AOC與GSSG含量在輻射后未見明顯變化。GSH含量在輻射后7 d較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），輻射后14 d較對(duì)照組、輻射后7 d明顯降低（P＜0.05）（表 1）。

圖 1 60Co γ輻射后不同時(shí)間裸鼴鼠腎臟（A～C）、肺臟（D～F）、骨骼?。℅～I(xiàn)）組織學(xué)觀察Figure 1 Histopathological observation on the kidney (A-C), lung (D-F) and skeletal muscle (G-I) tissues of naked mole rats at different time points after 60Co γ radiation

2.2.2 肺臟 肺臟組織中的MDA含量在輻射后7 d明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），輻射后14d較對(duì)照組、輻射后7 d有明顯升高（P＜0.005）。T-AOC在輻射后7 d、輻射后14 d均低于對(duì)照組（P＜0.005，P＜0.01）。GSH含量在輻射后7d與對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.005），輻射后14 d較對(duì)照組、輻射后7d有顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。GSSG含量在輻射后7 d與對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.05），輻射后14 d較對(duì)照組、輻射后7d有明顯升高（P＜0.01）（表1）。2.2.3 骨骼肌 骨骼肌中MDA含量在輻射后7 d明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），輻射后14d明顯低于輻射后7 d（P＜0.01），但仍明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。T-AOC在輻射后7 d和14 d均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。GSH和GSSG含量在輻射后7d與對(duì)照組相比明顯降低（P＜0.01），輻射后14 d均明顯高于對(duì)照組、輻射后7 d（P＜0.01）（表 1）。

表 1 60Co γ射線輻射對(duì)裸鼴鼠腎臟、肺臟、骨骼肌氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Table 1 Effects of 60Co γ-ray radiation on indicators of oxidative stress in kidney, lung and skeletal muscle of naked mole rats

3 討論

在人類生存環(huán)境中，輻射無處不在，除天然輻射外，工業(yè)核污染、醫(yī)療放射以及日常生活中的電器輻射，均可對(duì)人類造成不同程度的輻射損傷[8-9]。其中，天然輻射和醫(yī)療放射是造成人類輻射損傷的主要輻射來源，當(dāng)輻射達(dá)到一定劑量，會(huì)產(chǎn)生急性放射病，導(dǎo)致器官損傷，細(xì)胞癌變概率增加[10]。因此，開展輻射損傷防治研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前輻射相關(guān)的研究主要圍繞小鼠、大鼠和小型豬等。王敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)，昆明小鼠在受到5 Gy X 射線全身輻射后，會(huì)發(fā)生腎小球腫脹，腎小管和集合管上皮細(xì)胞空泡化、凋亡、壞死。周中林等[12]研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠在受到6 Gy60Co γ一次性全身輻射后，肺組織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不清晰，肺泡間隔斷裂，部分肺泡融合。陳超等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在經(jīng)少量多次輻射之后，骨組織骨髓腔內(nèi)紅骨髓減少，間質(zhì)細(xì)胞炎性浸潤。在本研究中，裸鼴鼠經(jīng)過60Co γ射線10 Gy一次性全身輻射后，鏡下可見腎臟細(xì)胞大小正常，未出現(xiàn)炎性反應(yīng)以及明顯的腫脹、凋亡、壞死等病變；肺臟組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡大小正常，僅偶見肺泡間隔輕微增厚，有少量炎性細(xì)胞浸潤，未出現(xiàn)肺泡腔滲出液和出血、成纖維細(xì)胞增生、肺組織局灶性實(shí)變等病變；未觀察到骨骼肌纖維萎縮、壞死和纖維化，間質(zhì)細(xì)胞炎性浸潤等變化。結(jié)果表明輻射對(duì)裸鼴鼠腎臟、肺臟和骨骼肌影響較小，提示受到輻射刺激后的裸鼴鼠腎臟、肺臟和骨骼肌仍然能夠維持良好的穩(wěn)定性。與小鼠以及其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物構(gòu)建的輻射損傷模型相比，裸鼴鼠這一獨(dú)特的生物學(xué)特性或可為后期輻射損傷防治研究提供參考。

輻射損傷效應(yīng)除表現(xiàn)在組織學(xué)，還表現(xiàn)在分子水平上，主要表現(xiàn)為化學(xué)鍵破壞誘發(fā)的水分子、DNA、蛋白質(zhì)等電離。水分子在電離時(shí)可產(chǎn)生活性氧簇和活性氮自由基，改變細(xì)胞正常氧化過程而損害健康[13-14]。脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA是機(jī)體受到氧化損傷的重要標(biāo)志[15]。本研究中輻射后裸鼴鼠腎臟、肺臟和骨骼肌中MDA含量均明顯升高（P＜0.01），表明氧化自由基在裸鼴鼠體內(nèi)迅速積累，發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。GSSG和GSH是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化和自由基清除劑，正常情況下機(jī)體以GSH形式存在為主，GSH含量是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要指標(biāo)[16-17]。輻射后裸鼴鼠肺臟、骨骼肌中GSH和GSSH水平在7 d時(shí)出現(xiàn)明顯降低，提示抗氧化物質(zhì)消耗；但與小鼠的情況[18]不同的是，裸鼴鼠GSH和GSSH水平在輻射后14 d出現(xiàn)明顯回升，表明裸鼴鼠可能在受到氧化應(yīng)激損傷后，通過提高體內(nèi)抗氧化產(chǎn)物表達(dá)水平來提高裸鼴鼠耐受輻射的能力。裸鼴鼠腎臟GSH水平在輻射后7 d時(shí)顯著增高，14 d顯著下降；GSSG沒有發(fā)生顯著變化，較肺臟和骨骼肌而言，裸鼴鼠腎臟能迅速提高抗氧化能力來抵抗氧化損傷。T-AOC反映的是機(jī)體總體的抗氧化能力，其數(shù)值的高低反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[16]。與對(duì)照組相比，輻射后裸鼴鼠腎臟T-AOC在沒有明顯變化，肺臟T-AOC在輻射7 d后水平明顯降低，但在14 d已經(jīng)回升并接近對(duì)照組，骨骼肌T-AOC在14 d仍然維持7 d水平，提示裸鼴鼠機(jī)體有較強(qiáng)的抗氧化能力恢復(fù)力，幫助機(jī)體抵抗輻射損傷。

綜上所述，輻射后裸鼴鼠腎臟、肺臟和骨骼肌發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但在組織學(xué)觀察時(shí)并未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的病理損傷。一方面表明裸鼴鼠對(duì)輻射具有一定程度的耐受能力，另一方面也表明裸鼴鼠體內(nèi)還存在其他尚未明確的過氧化清除機(jī)制，這為后續(xù)研究裸鼴鼠耐輻射機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。