腫瘤類器官模型的建立及應用

羅寶花，張永斌，劉曉秋，師長宏

(1. 廣州中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心/實驗動物中心，廣州 510405；2. 空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，西安 710032)

人體腫瘤研究常用的動物模型主要有人源腫瘤細胞系移植（cell-derived xenograft，CDX）模型和人源腫瘤組織異種移植（patient-derived xenograft，PDX）模型。CDX模型是將人體腫瘤細胞先在體外二維培養(yǎng)環(huán)境下進行培養(yǎng)，經(jīng)過篩選、傳代，形成穩(wěn)定的腫瘤細胞系，然后注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立的模型；該模型的建立操作簡單，且腫瘤細胞可在體外無限增殖，便于進行基因編輯操作，但是腫瘤細胞在體外培養(yǎng)過程中，會被含血清培養(yǎng)基誘導發(fā)生轉(zhuǎn)化，對培養(yǎng)環(huán)境進行適應和選擇，從而失去原發(fā)腫瘤細胞的異質(zhì)性[1-2]。PDX模型是將患者來源的腫瘤細胞或組織移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立的模型，較好地保留了腫瘤干細胞和基質(zhì)成分，生長環(huán)境更接近原發(fā)腫瘤，能夠較好地維持原發(fā)腫瘤的特性；但是在小鼠體內(nèi)傳代過程中，人源性腫瘤基質(zhì)會逐漸被鼠源性基質(zhì)代替，從而改變腫瘤微環(huán)境，逐漸丟失原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性，不適用于低惡性或慢性進展的腫瘤研究，而且其總體移植成功率低，實驗周期長，費用高，限制了該模型的應用[1-3]。因此，需要建立更好的動物模型來進行人體腫瘤研究，以促進人們對腫瘤的認識。

類器官技術(shù)是近年來最重要的科學進展之一，是一類具有廣泛應用前景的體外培養(yǎng)技術(shù)。運用該技術(shù)建立的腫瘤人源類器官（patientderived organoids，PDO）是一種來源于腫瘤特異性干細胞的三維（three dimensions，3D）多細胞團，具有和來源腫瘤組織高度相似的生物學特性。它不僅培養(yǎng)成功率高，周期短，可以在體外大量擴增，進行基因編輯操作，而且遺傳穩(wěn)定，長期傳代后仍然能夠準確再現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性，可同時建立配對的正常組織類器官以進行對照分析。與CDX和PDX模型相比（表1），PDO模型既同時具備了二者的優(yōu)勢，又彌補了它們的不足[1-4]，近年來已被廣泛應用于腫瘤研究。

表 1 CDX、PDX和PDO腫瘤模型的比較Table 1 Comparison of CDX, PDX and PDO tumor models

1 腫瘤類器官的發(fā)展簡史

20世紀90年代，Lindberg等[5]和Pellegrini等[6]利用人角膜緣干細胞成功在體外培養(yǎng)出3D眼角膜結(jié)構(gòu)，首次實現(xiàn)了人源性細胞的3D培養(yǎng)。2009年，Clevers研究團隊在Nature雜志上首次報道了腸道類器官體系的建立，開啟了類器官研究的新時代[7]。2011年，Sato等[8]運用類器官技術(shù)率先建立了腫瘤類器官。2015年，全球首個腫瘤類器官庫被建立[9]。自此以后，研究者們逐漸建立起各種腫瘤的類器官庫[10-21]（表2）。

2 腫瘤類器官模型的建立方法

2.1 培養(yǎng)體系

培養(yǎng)腫瘤類器官首先要制備出含腫瘤干細胞的懸液，然后將其置于一個支持介質(zhì)（多為基質(zhì)膠Matrigel或基底膜提取物）上，待其固化后加入合適的培養(yǎng)基進行3D生長，培養(yǎng)數(shù)日后，就可形成與原發(fā)腫瘤結(jié)構(gòu)和功能相似的3D多細胞團，之后每1～2周傳代1次。其培養(yǎng)關(guān)鍵是要在體外人為地模擬出體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，誘導干細胞自主完成類器官的自組裝過程。

體外培養(yǎng)體系一般由生長調(diào)節(jié)因子和細胞外基質(zhì)兩部分組成，其中細胞外基質(zhì)多選用基質(zhì)膠（Matrigel）[22]。但實際上，培養(yǎng)不同的腫瘤類器官，甚至同一腫瘤類器官的不同亞型，需要的培養(yǎng)基條件不盡相同[8]，因此應將不同的培養(yǎng)基條件進行不同組合，以尋求最佳的培養(yǎng)方案，提高培養(yǎng)成功率。如Kopper等[21]在培養(yǎng)卵巢癌各種亞型衍生的腫瘤類器官時發(fā)現(xiàn)，在液體硫乙醇酸鹽（fluid thioglycollate，F(xiàn)T）培養(yǎng)基中加入氫化可的松、forskolin和調(diào)節(jié)蛋白（heregulin）β-1可以明顯提高卵巢癌類器官的衍生效率；同時他們還觀察發(fā)現(xiàn)，Wnt（一類分泌型糖蛋白）生態(tài)位因子并不是所有腫瘤亞型必需的。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤類器官的生長速度較其對應正常組織類器官的生長速度慢，可能是由于有絲分裂異?；蚣毎劳鏊耓23]。因此，在體外培養(yǎng)腫瘤類器官時，要避免混雜其中的殘余正常組織形成的類器官過度生長，應使用選擇性培養(yǎng)基或純化的腫瘤細胞樣本進行腫瘤類器官培養(yǎng)[8]。如Nanki等[24]用Nutlin-3（一種鼠雙微體基因2拮抗劑）選擇性培養(yǎng)基來抑制正常胃類器官的增殖，從而獲得含TP53基因突變的純胃癌類器官。

表 2 腫瘤類器官庫Table 2 Tumor organoids biobank

2.2 已建立的腫瘤類器官模型的特點

腫瘤來源的類器官可以通過手術(shù)切除或活檢的方式從實體腫瘤或循環(huán)腫瘤細胞中建立，與需要大樣本量的PDX模型不同，PDO可以從來源于針活檢的小樣本量培養(yǎng)形成，具有很高的建模成功率，而且所需時間短，傳代穩(wěn)定，經(jīng)體外長期培養(yǎng)后仍可保留原發(fā)腫瘤的體內(nèi)特征，具有與來源腫瘤相同的組織形態(tài)學、遺傳學特征及腫瘤標志物。此外，PDO還可以根據(jù)需要移植入免疫缺陷小鼠建立PDX模型，在免疫缺陷小鼠內(nèi)表現(xiàn)出與原代腫瘤細胞相同的致瘤能力，以及侵襲、轉(zhuǎn)移等臨床特性。表3總結(jié)了目前已建立的腫瘤類器官的特征。

表 3 已建立的腫瘤類器官的特征Table 3 The characteristics of established tumor organoids

3 腫瘤類器官模型的應用前景

與傳統(tǒng)腫瘤模型相比，腫瘤類器官模型具有諸多優(yōu)勢，可作為腫瘤研究的理想模型，在腫瘤研究領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。

3.1 用于研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機制

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡化，再到病灶轉(zhuǎn)移是一個相互關(guān)聯(lián)的過程，了解該過程中每一步的具體作用機制對于腫瘤的防治具有重要意義，這需要構(gòu)建腫瘤發(fā)生和發(fā)展不同階段的體外模型；傳統(tǒng)腫瘤模型暫且無法實現(xiàn)，而應用類器官技術(shù)有望實現(xiàn)突破。通過模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，針對腫瘤發(fā)展的所有階段（包括正常時期、侵襲前期、侵襲期和轉(zhuǎn)移期）都可建立相應的類器官，從而進行相關(guān)的機制研究。

3.1.1 認識傳染性病原體與腫瘤發(fā)生的關(guān)系 許多腫瘤的發(fā)生與病原體感染密切相關(guān)[25]，但病原體是如何導致腫瘤發(fā)生的過程尚不清楚。運用類器官技術(shù)，建立不同病原體與類器官的共培養(yǎng)體系，可用來研究這些過程。如Buti等[26]在幽門螺桿菌和胃類器官的共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌的毒力因子CagA通過與p53-2凋亡刺激蛋白（apoptosis stimulating protein of p53-2，ASPP2）結(jié)合，誘導p53降解，使p53促細胞凋亡的活性喪失，同時誘導細胞極性復合物PAR重塑，使細胞極性喪失，促進上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，從而導致胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。此外，類器官-病毒共培養(yǎng)模型也可以用于腫瘤發(fā)生和發(fā)展機制的研究。Ramani等[27]在腦類器官和Zika病毒的共培養(yǎng)體系中觀察發(fā)現(xiàn)，感染Zika病毒后，腦類器官中特異性神經(jīng)元基因的表達上調(diào)。上述共培養(yǎng)體系使得研究病原體誘導特異性基因表達調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展成為可能。

3.1.2 識別導致腫瘤進展的驅(qū)動突變 腫瘤的發(fā)生是大量基因突變不斷累積的結(jié)果，但只有其中的少數(shù)突變會導致腫瘤進展[28]，稱為驅(qū)動突變。腫瘤的異質(zhì)性使真正的驅(qū)動突變難以被識別，類器官技術(shù)有望解決這一難題。類器官技術(shù)的突出優(yōu)點是能夠同時建立來源于同一患者的正常組織類器官和腫瘤組織類器官，其中正常組織類器官的遺傳信息相對穩(wěn)定，可作為研究腫瘤突變的良好對照模型[29]，通過比較腫瘤類器官與正常組織類器官的基因表達情況可以推斷出可能的驅(qū)動突變，然后加以驗證。例如Chio等[30]發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）在同一患者胰腺癌類器官中的表達水平較正常胰腺類器官高；當利用基因編輯技術(shù)敲低NRF2基因表達后，胰腺癌類器官的生長受到抑制，而正常胰腺類器官的生長不受影響，說明NRF2很可能是胰腺癌的驅(qū)動突變基因。上述模型的研究結(jié)果提示，腫瘤的發(fā)生與驅(qū)動突變密切相關(guān)，這些突變可能可以作為腫瘤防治的潛在靶點。

3.2 用于藥物篩選并指導個體化治療

異質(zhì)性是腫瘤研究面臨的一個重大難題，也是開展腫瘤個體化治療的重要原因之一[1]。過去最常用的癌癥藥物篩選模型是腫瘤細胞系，它可以在體外無限增殖，進行高通量藥物篩選；但是在傳代過程中，腫瘤細胞會對二維培養(yǎng)環(huán)境進行適應和選擇，丟失親本腫瘤的異質(zhì)性，導致藥物臨床前實驗結(jié)果和臨床試驗療效存在較大差異，不能有效評估腫瘤藥物的療效和安全性。而PDX模型雖可在短期內(nèi)較好地保留腫瘤異質(zhì)性，但其操作復雜、培養(yǎng)周期長且費用昂貴，不適用于藥物高通量篩選。與傳統(tǒng)的藥物篩選模型相比，腫瘤類器官模型不僅可以在體外穩(wěn)定傳代，大量擴增，滿足藥物高通量篩選的要求，而且可以較好地維持原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性，具有更精確的藥物反應預測優(yōu)勢，可以更好地指導個體化治療。Vlachogiannis等[15]利用胃腸道腫瘤類器官庫與相應的臨床試驗進行比較，證實腫瘤類器官可以準確地預測藥物療效；分析數(shù)據(jù)顯示，腫瘤類器官有著100%敏感性、93%特異性、100%陰性預測值和88%陽性預測值。Roerink等[31]通過對結(jié)直腸癌類器官進行“批量”單細胞測序和藥物療效觀察，發(fā)現(xiàn)來自同一患者甚至具有相似突變特征的腫瘤細胞對同一化療藥物的反應也不盡相同。這些模型證實了腫瘤類器官對藥物反應具有精確預測優(yōu)勢，甚至還具有在個體患者中揭示異質(zhì)性的潛力。

類器官模型用于藥物篩選的另一突出優(yōu)勢是源自同一患者的腫瘤組織和正常組織都可以在體外培養(yǎng)形成類器官，對兩者先后進行藥物敏感性試驗和藥物毒性測試，可以篩選出專門針對腫瘤細胞而不損傷健康細胞的藥物，從而減少藥物對病人的毒性作用。

3.3 促進腫瘤免疫治療

免疫治療旨在利用人體免疫系統(tǒng)殺滅腫瘤細胞，其效能依賴于腫瘤相關(guān)基因突變產(chǎn)生的抗原（即新抗原）負荷，足夠的免疫原性才能觸發(fā)有效的免疫應答[32-33]。然而，多數(shù)情況下，患者在腫瘤新抗原誘導下產(chǎn)生的免疫應答強度是不夠的。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤類器官與免疫細胞共培養(yǎng)可以實現(xiàn)效應T細胞的體外激活和擴增。例如Dijkstra等[34]研究發(fā)現(xiàn)，源于同一患者的腫瘤類器官與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)可以產(chǎn)生CD8＋T細胞，而且由于新抗原的存在，可刺激CD8＋T細胞持續(xù)增殖，成功建立了效應T細胞的體外富集方法。此外，他們還證實了這些效應T細胞能夠有效識別和殺死腫瘤細胞，而不殺傷正常組織細胞。因此，可以通過將體外激活擴增的大量效應T細胞移植入原患者體內(nèi)，強化患者對腫瘤細胞的免疫應答，從而實驗腫瘤免疫治療[35]。還有研究證實，胸腺類器官可為體外有效擴增效應T細胞提供更接近體內(nèi)生理狀態(tài)的微環(huán)境[36]。這些研究結(jié)果均說明，腫瘤類器官技術(shù)可以有效活化效應T細胞，增強腫瘤特異性免疫應答水平，促進人體免疫系統(tǒng)殺滅腫瘤細胞。

3.4 與液體活檢聯(lián)合應用

液體活檢是近幾年迅速發(fā)展的一項生物技術(shù)。與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢以非侵入性為主要特點，具有無創(chuàng)性和實時性。液體活檢以血液樣本作為主要分析材料，在獲取患者少量血液后，分離出循環(huán)腫瘤細胞，再利用二代測序技術(shù)制定個性化的治療方案，致力于腫瘤的早期診斷、監(jiān)測，并指導治療。循環(huán)腫瘤細胞是因自發(fā)或診療操作而從原發(fā)腫瘤實體或轉(zhuǎn)移病灶脫落到外周血循環(huán)中的一類腫瘤細胞，其數(shù)量變化、細胞表型、擴增能力和藥敏測試等指標與腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、分級、轉(zhuǎn)移及預后等密切相關(guān)[37-38]。長期以來，腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性是傳統(tǒng)組織活檢難以攻克的難題之一，液體活檢有望在這一問題上實現(xiàn)突破。循環(huán)腫瘤細胞可作為有創(chuàng)性活組織檢查的替代品，用于腫瘤異質(zhì)性研究。但液體活檢在循環(huán)腫瘤細胞的檢測和富集上存在缺陷，獲取的循環(huán)腫瘤細胞較少，不能滿足研究需要。腫瘤類器官可以從小樣本量培養(yǎng)形成，恰好可以避免這一問題。2014年，Gao等[11]證實了利用來源于患者外周血的少量循環(huán)腫瘤細胞進行腫瘤類器官培養(yǎng)的可行性；并且通過全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)，來源于循環(huán)腫瘤細胞的前列腺癌類器官保留了與原發(fā)腫瘤相一致的分子多樣性，包括TMPRSS2-ERG融合、SPOP突變、SPINK1過表達和CHD1丟失。液體活檢聯(lián)合腫瘤類器官將為攻克腫瘤異質(zhì)性難題提供一個新的研究策略。

4 腫瘤類器官模型的局限性

盡管腫瘤類器官模型有著諸多優(yōu)勢，但仍存在一些局限性。（1）體外培養(yǎng)體系缺少體內(nèi)腫瘤微環(huán)境成分，如基質(zhì)細胞、免疫細胞、神經(jīng)和血管等，不能完全代表腫瘤在體內(nèi)所處的環(huán)境。如何在體外培養(yǎng)體系中重建腫瘤微環(huán)境，將是未來研究的一個方向。（2）類器官培養(yǎng)體系含有各種成分，可能對實驗結(jié)果造成不確定的影響。（3）腫瘤類器官培養(yǎng)技術(shù)尚未成熟，培養(yǎng)條件復雜，更簡單、高效的培養(yǎng)方案仍需進一步摸索。（4）截至目前，已報道的腫瘤類器官模型大多屬于上皮來源，只有一例屬于非上皮來源[39]。類器官技術(shù)是否適用于非上皮來源的腫瘤類器官培養(yǎng)，仍需進一步探索。

5 結(jié)語

腫瘤類器官模型體外培養(yǎng)成功率高，所需形成時間短，成本低，傳代穩(wěn)定，可以較好地再現(xiàn)原發(fā)腫瘤的體內(nèi)特征及異質(zhì)性，可以進行相關(guān)遺傳操作，而且可以冷凍保存后再復蘇培養(yǎng)，這些特點使各種腫瘤類器官庫得以建立，為大量實驗研究提供了充足的數(shù)據(jù)支持。雖然目前腫瘤類器官仍存在一些局限性，但隨著研究的不斷深入、技術(shù)的不斷革新，相信腫瘤類器官模型會在腫瘤研究方面發(fā)揮越來越重要的作用。