小鼠胚胎移植影響因素的初步探索

桂 飛，楊偉偉，孫筱品，顧美兒

（杭州師范大學(xué)實驗動物中心，杭州 310036）

目前，轉(zhuǎn)基因小鼠品系已被廣泛應(yīng)用，但在病原微生物控制、冷凍保種、品系復(fù)蘇和快速擴(kuò)增繁殖等方面仍面臨很大的挑戰(zhàn)。其中，通過體外受精獲得大量胚胎，并采用胚胎移植方法成功植入受體雌鼠輸卵管，這是病原微生物控制和輔助生殖過程中不可或缺的一項技術(shù)[1]，既可以達(dá)到生物凈化的目的，有效控制病原微生物的感染[2-3]，同時也可以實現(xiàn)快速擴(kuò)增繁殖，獲得大量子代小鼠。影響胚胎移植的因素有很多：一方面，不同品系之間的胚胎存在差異[4]，其中近交系胚胎更敏感，存活率更低[5]；另一方面，子宮承受能力也會影響移植成功率，包括單側(cè)或者雙側(cè)移植、移植胚胎數(shù)量等因素[6]。本研究基于本中心過去幾年的胚胎移植實驗數(shù)據(jù)，分析影響胚胎移植的主要因素，以期探索更加高效的實驗策略，為小鼠胚胎移植提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用APPSWE、SYN-a30p、Sox10-DTA、GFAP-creER、P53flox、ErbB2、MHC-cko、Sox10和Nrn1等277個基因修飾小鼠品系的雄鼠均由杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院和生命科學(xué)院邱猛生、張遵義、劉陽、陶艷梅、鞠振宇、劉俊平和楊磊等多個課題組提供，每個品系1～2只，8～12周齡。工具鼠：4周齡C57BL/6供體雌鼠，用于超數(shù)排卵，提供卵母細(xì)胞，每個品系5只；ICR結(jié)扎雄鼠150只，8～12周齡，用于與ICR受體雌鼠交配獲得假孕雌鼠；6～8周齡ICR假孕雌鼠，用于胚胎移植，每個品系3只。所有工具鼠均由杭州師范大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK（浙）2016-0004]。所有小鼠均飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境中[SYXK（浙）2016-0006]，可以自由采食和飲水。待動物充分適應(yīng)環(huán)境后，在符合動物福利倫理的條件下進(jìn)行實驗，倫理審批編號為2019175。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）均購自寧波市三生藥業(yè)有限公司。苯巴比妥鈉購自福建閩東力捷訊藥業(yè)股份有限公司。M2培養(yǎng)液購自美國Thermo公司，精子獲能液TYH（Toyodo Yokojama and Hoshi）和人輸卵管培養(yǎng)液（human tubal fluid，HTF）等系本實驗室自制[7-8]。

1.3 主要儀器與設(shè)備

體式顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。二氧化碳培養(yǎng)箱和生物安全柜為美國Thermo公司產(chǎn)品、超凈工作臺為蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。恒溫?zé)崤_為上海蔡康光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，電子天平為德國Sartorius公司產(chǎn)品。移卵針為北京正天易科貿(mào)有限公司產(chǎn)品。吸卵管參照文獻(xiàn)[9]改良制作，其中所用橡膠軟管和0.22 μm過濾器均經(jīng)過嚴(yán)格的消毒滅菌處理，將過濾器兩端連接橡膠軟管后，檢測氣密性良好即可使用。

1.4 胚胎收集

本研究所用277個基因修飾小鼠的背景品系均為C57BL/6，所以選用C57BL/6供體雌鼠進(jìn)行超數(shù)排卵，腹腔注射一定劑量（5～10U/只）的PMSG，46～48 h后對應(yīng)注射等量的hCG。12～14h后，以頸椎脫臼法處死供體雌鼠，切開腹部，取出輸卵管，從壺腹部分離取出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，置于HTF培養(yǎng)滴中，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱中孵育。

在生物安全柜中，以頸椎脫臼法處死雄鼠，切開腹部，暴露出雄鼠睪丸和附睪等組織，分離出附睪，刺破/剪破后取出精液，置于TYH培養(yǎng)滴中，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育30～60 min。光學(xué)顯微鏡下觀察精子的活力和狀態(tài)，根據(jù)精子狀態(tài)，取適量的精子滴于孵育好的卵母細(xì)胞培養(yǎng)滴中，進(jìn)行體外受精。

受精后4 h左右，更換培養(yǎng)液，清洗胚胎3次后，繼續(xù)放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至次日上午，于顯微鏡下挑選出成功受精的2-細(xì)胞胚胎，分選并統(tǒng)計數(shù)量，計算體外受精率。體外受精率＝受精后的2-細(xì)胞數(shù)/總卵母細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 胚胎移植

移植前1 d將ICR受體雌鼠與結(jié)扎雄鼠合籠處理，根據(jù)所需受體雌鼠數(shù)量，按照25%見栓率進(jìn)行合籠。第二天早上進(jìn)行檢栓操作，見栓的受體即為假孕雌鼠。

將假孕受體雌鼠麻醉，剃除腹部毛發(fā)，在此處剪開小口，用鑷子取出輸卵管，用止血夾夾住脂肪墊固定輸卵管位置。用嘴吸式移植針吸取2-細(xì)胞胚胎20枚，在體式顯微鏡下移植至單側(cè)或雙側(cè)輸卵管的壺腹部前段。移植完成后，縫合手術(shù)創(chuàng)口，置于恒溫?zé)崤_，待受體雌鼠蘇醒后，再飼養(yǎng)于籠盒中。移植后14d，即可觀察移植受體雌鼠是否妊娠，妊娠率＝妊娠雌鼠數(shù)/移植受體雌鼠總數(shù)×100%。移植后19～21 d，小仔出生，即可統(tǒng)計窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔率，窩產(chǎn)仔率＝窩產(chǎn)仔數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。由于胚胎不發(fā)生經(jīng)子宮遷移，因此本實驗對比單側(cè)移植和雙側(cè)移植的效果，擬通過雙側(cè)移植的方法減輕子宮負(fù)荷。實驗分別將每個轉(zhuǎn)基因品系的胚胎單側(cè)移植20枚至受體雌鼠一側(cè)的輸卵管內(nèi)，雙側(cè)移植則是在受體雌鼠的兩側(cè)輸卵管內(nèi)分別移植入10枚同一品系胚胎，移植完成后縫合創(chuàng)口，置于熱臺待其蘇醒后單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察小鼠妊娠及產(chǎn)仔情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。277個品系分組后，每個品系至少移植3只受體鼠，結(jié)果數(shù)據(jù)以表示。使用卡方檢驗來分析體外受精率是否與妊娠率及窩產(chǎn)仔率相關(guān)。采用單因素方差分析和事后Tukey’s多重比較檢驗分析移植胚胎數(shù)和窩產(chǎn)仔數(shù)是否相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同受精率品系對移植后窩產(chǎn)仔率的影響

按照體外受精率不同，將277個品系分為0%～39%、40%～59%、60%～69%、70%～79%、80%～89%、90%～100% 共 6組進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，胚胎移植后各組間妊娠率沒有明顯差異（均P＞0.05）。體外受精率在0%～39%的品系窩產(chǎn)仔數(shù)（4.61±1.92）和產(chǎn)仔率（19.21%±9.70%）均顯著低于其他各組（均P＜0.01）；體外受精率在60%～69%的品系窩產(chǎn)仔率最高[（30.89±10.53）%]，而90%～100% 組[（25.57±9.36）%]比60%～69%組的窩產(chǎn)仔率明顯降低（P＜0.05）；其余各組間未見明顯差異（均P＞0.05）。結(jié)果表明，體外受精率低于40% 的品系胚胎移植后的產(chǎn)仔率明顯降低，平均每只受體產(chǎn)仔數(shù)也明顯減少。

表 1 不同受精率品系對移植后窩產(chǎn)仔率的影響Table 1 Effect of mouse strains with different fertility rate on the litter rate after transplantation(，n=3)

表 1 不同受精率品系對移植后窩產(chǎn)仔率的影響Table 1 Effect of mouse strains with different fertility rate on the litter rate after transplantation(，n=3)

注：#根據(jù)不同品系小鼠的體外受精率進(jìn)行分組。與其他各組比較，**P<0.01；與60%～69%組比較，*P<0.05。

組 別# 品系/個 受精率/% 妊娠率/% 窩產(chǎn)仔數(shù)/只 產(chǎn)仔率/%0%～39%40%～59%60%～69%70%～79%80%～89%90%～100%18 20 29 51 106 53 21.87±12.13 51.53±5.74 66.07±2.68 75.31±3.00 85.06±2.95 93.58±2.68 84.35±21.08 (49/60)86.65±25.21 (38/60)79.82±29.84 (48/73)86.02±37.52 (86/154)84.73±23.31 (245/297)85.06±19.54 (97/151)4.61±1.92**6.70±2.11 7.14±1.78 6.55±2.03 6.17±1.71 6.06±1.60 19.21±9.70**28.46±12.98 30.89±10.53 28.26±13.46 26.32±11.57 25.57±9.36*

2.2 移植胚胎數(shù)量對窩產(chǎn)仔率的影響

不同數(shù)量胚胎的移植結(jié)果（表2）顯示，移植胚胎數(shù)較少（5枚）時，可以成功使受體妊娠，但是可能發(fā)出維持妊娠所必需的信號不足[10-11]，導(dǎo)致雌鼠母性較差，小仔出生后容易發(fā)生食仔的現(xiàn)象，小仔存活率較低。移植胚胎數(shù)在10枚以上時，各組窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔率均較高；其中，胚胎移植數(shù)量在15枚左右時產(chǎn)仔率最高，達(dá)到（46.67±11.56）%，均明顯高于其他各組（均P＜0.01），表明此時胚胎利用率最大。移植數(shù)量達(dá)到25枚時，平均每只移植受體小鼠的產(chǎn)仔數(shù)最多（9.67±1.53），均明顯多于其他各組（均P＜0.01）。移植胚胎數(shù)繼續(xù)增加到30枚后，窩產(chǎn)仔數(shù)（8.33±0.58）和產(chǎn)仔率[（27.33±2.31）%]均有所下降，表明此時已超過小鼠子宮能承受的最大負(fù)荷。因此，移植胚胎數(shù)在15枚左右時利用率最大，移植胚胎數(shù)在25枚左右時獲得子代小鼠數(shù)量最多，此時子宮承載能力幾乎達(dá)到最大。

2.3 單側(cè)移植和雙側(cè)移植的比較

統(tǒng)計分析基因修飾品系Sox10的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單側(cè)移植和雙側(cè)移植的窩產(chǎn)仔數(shù)分別為（4.75±0.96）只和（5.33±0.58）只，產(chǎn)仔率分別為（26.25±7.50）%和（26.67±2.88）%，單側(cè)移植和雙側(cè)移植之間無明顯差異（P＞0.05）。同時還對TLR4等多個品系進(jìn)行了相應(yīng)的實驗，發(fā)現(xiàn)單雙側(cè)移植的比較趨勢均與Sox10品系一致。

表 2 移植胚胎數(shù)量對窩產(chǎn)仔率的影響Table 2 Effect of the number of transfer red embryo on the litter rate(x- ± s，n=3)

3 討論

轉(zhuǎn)基因小鼠的背景品系比較復(fù)雜[10]，但大多采用C57BL/6品系。本研究中選用的277個小鼠品系的遺傳背景均為C57BL/6，研究發(fā)現(xiàn)這些品系的體外受精率不同對胚胎移植后受體妊娠率沒有明顯影響，但當(dāng)受精率在40%以下時受體平均窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔率均顯著降低，表明受精率較低的品系獲得的2-細(xì)胞胚胎質(zhì)量也可能受到一定的影響，胚胎發(fā)育受阻，導(dǎo)致產(chǎn)仔率降低。體外受精率較低的品系，建議適當(dāng)增加移植胚胎或受體的數(shù)量，以獲得足夠量的子代小鼠。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，不同品系之間存在一定的差異，大部分受精率低于40%的品系窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔率均明顯降低，但極少數(shù)品系如Erf、Rosa-eGFP-DTA等的受精率較低，而胚胎移植后窩產(chǎn)仔率較高。目前，人們對造成這種現(xiàn)象的具體原因尚不清楚，有待進(jìn)一步實驗研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，移植胚胎數(shù)較少（5枚）時，移植受體可以成功妊娠，但是由于出生小鼠數(shù)量較少，小仔出生后，容易發(fā)生食仔的現(xiàn)象，小仔存活率較低。Dorsch等[6]研究發(fā)現(xiàn)，移植胚胎數(shù)在3～5枚時，可使移植受體成功妊娠，與本研究結(jié)果相一致。另有文獻(xiàn)報道，胎盤只有在蛻膜化后才能維持妊娠，而小鼠和大鼠中只有囊胚存在時才發(fā)生妊娠，可能3～5個胚胎不足以發(fā)出維持妊娠所必需的信號[11-12]。然而這些研究報道仍不能解釋本研究中移植3～5枚即可發(fā)生妊娠的現(xiàn)象。

移植胚胎數(shù)在10枚以上時，各組窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔率均較高。其中，胚胎移植數(shù)量在15枚左右時窩產(chǎn)仔率最高，達(dá)到（46.67±11.56）%，表明此時胚胎利用率最大。移植數(shù)量達(dá)到25枚時，平均每只移植受體小鼠的產(chǎn)仔數(shù)（9.67±1.53）最多。移植胚胎數(shù)繼續(xù)增加到30枚后，窩產(chǎn)仔數(shù)（8.33±0.58）和產(chǎn)仔率[（27.33±2.31）%]均有所下降，表明此時已超過小鼠子宮能承受的最大負(fù)荷。Dorsch等[6]研究表明，移植新鮮胚胎數(shù)在18～20枚時，移植效果最好；當(dāng)移植胚胎數(shù)＞21枚時，窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔率均會出現(xiàn)大幅下降，這與本研究結(jié)果有一定的差異。雌性小鼠共有5對乳房，故產(chǎn)仔數(shù)控制在10只以內(nèi)，對小仔后續(xù)的生長發(fā)育比較有保障。Johnson等[13]提出一種“子宮容量”的觀點(diǎn)，他們認(rèn)為子宮的容量超過一定極限后，就不能再維持胚胎的發(fā)育，這在一定程度上可解釋本實驗中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象：當(dāng)移植胚胎數(shù)達(dá)到30枚以上時，窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔率均降低。

已有研究表明，胚胎不發(fā)生經(jīng)子宮遷移[14]。因此，本實驗還對比了單側(cè)移植和雙側(cè)移植的效果，考慮采用雙側(cè)移植的方法減輕子宮負(fù)荷。然而分析結(jié)果表明，單側(cè)移植和雙側(cè)移植后的窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔率均未見明顯差異。雙側(cè)移植需要在左右兩側(cè)均進(jìn)行移植手術(shù)操作，較單側(cè)移植的操作難度大，對動物創(chuàng)傷也比較大，這可能會影響動物的妊娠率，故筆者建議采用單側(cè)移植即可。本實驗結(jié)果與Mahabir等[15]的研究結(jié)果相一致：單、雙側(cè)移植的效果未見顯著性差異。另外，需要說明的是，本實驗中部分品系的樣本量不足，無法將其一起統(tǒng)計，后續(xù)將進(jìn)一步補(bǔ)充研究。