液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測畜禽產(chǎn)品中的羥甲烯龍

王 晗， 趙曉亞， 葉 誠， 尚吟竹， 周 艷， 車志彥， 陳新艷， 鄭茜玥， 譚 杰， 吳建安， 王 鵬*

(武漢海關(guān)，湖北武漢 430050)

圖1 羥甲烯龍的化學(xué)式Fig.1 The chemical formula of oxymetholone

羥甲烯龍是一種合成代謝類雄激素，羥甲烯龍的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。該藥物能夠作為口服類固醇被動物吸收[1,2]，可以用于貧血和HIV相關(guān)的肌肉萎縮癥的治療。羥甲烯龍其在動物體內(nèi)不僅能促進蛋白質(zhì)合成、抑制蛋白質(zhì)異化，還能降低血膽固醇、減少鈣磷排泄、促進發(fā)育、組織新生和肉芽形成。因此，它可能被非法用于動物的育種和養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，并殘留在動物源性食品中。對于運動員這一特殊人群，羥甲烯龍是“國際反興奮劑組織”(WADA)明確禁用的蛋白同化制劑[3]，日常飲食中攝入含有羥甲烯龍的食品極有可能造成興奮劑陽性檢出[4 - 6]。對于普通消費者，羥甲烯龍的攝入則會造成肝臟及心血管損傷、引發(fā)睪丸癌及精神障礙等疾病[4,7]?；诖?，必須建立針對畜禽產(chǎn)品中羥甲烯龍的有效檢測方法。

羥甲烯龍的檢測手段包括氣相色譜-質(zhì)譜法[8]和液相色譜-串聯(lián)/質(zhì)譜法。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相較于氣相色譜-質(zhì)譜法的靈敏度更高、選擇性也較好，因此被廣泛應(yīng)用于合成代謝類雄激素的檢測之中[9 - 13]。但由于畜禽產(chǎn)品基質(zhì)差異較大，而羥甲烯龍在食品中的殘留量較低，因此目前文獻中的檢測方法往往僅適合于單一基質(zhì)，而建立通用于多種畜禽產(chǎn)品的檢測方法具有一定的難度。本工作擬采用基于液相萃取的前處理手段，與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用，建立適合于多種畜禽產(chǎn)品基質(zhì)中羥甲烯龍檢測的分析方法，用于畜禽產(chǎn)品中羥甲烯龍的食品安全監(jiān)督檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 6500型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB SCIEX,USA)；2-16PK型低溫離心機(Sigma,Germany)；MS2型漩渦混合儀(IKA,Germany)；TurboVap LV型氮吹儀(Biotage,Sweden)；MS型分析天平(Mettler Toledo Instruments Co.,Ltd.,China)。

羥甲烯龍標準品(純度≥98%)溶液：稱取羥甲烯龍標準品，用甲醇溶解，配制成濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，-18 ℃下避光保存，在實驗過程中精確吸取適量標準溶液，用0.1%甲酸-甲醇溶液逐級稀釋至所需濃度。β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶(β-葡萄糖醛酸酶活力>100 000 U/mL，芳基硫酸酯酶活力<20 000 U/mL)購自天津阿爾塔科技有限公司。甲醇、甲酸、乙醚、HAc均為色譜純試劑(LiChrosolv,Merck,Germany)，其他試劑為分析純。NaAc-HAc緩沖液：稱取13.6 g NaAc，溶解于500 mL水中，用適量HAc調(diào)節(jié)pH至5.2，該緩沖溶液用于動物源性樣品的酶解。

1.2 樣品制備

豬肉、牛肉、羊肉(約500 g)放入組織搗碎機均質(zhì)，充分混勻，備用。新鮮雞蛋取16枚(約1 kg)，洗凈去殼后充分混勻，備用。牛奶從冰箱中取出，放置至室溫，搖勻，備用。

稱取5.0000 g試樣置于50 mL離心管中，加入10 mL NaAc溶液，25 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，于溫度37 ℃條件下水浴振蕩2 h。向離心管中加入約1.5 mL飽和Na2CO3溶液使混合溶液的pH為10，加入20 mL乙醚，5 g NaCl和2 g無水MgSO4，劇烈搖晃后渦旋混勻1 min，振蕩提取30 min，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速在-4 ℃下離心10 min，取出后繼續(xù)放入-20 ℃冰箱中冷凍至水相凝固，取上層乙醚于50 mL離心管中，氮吹至近干，準確加入1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.3 色譜及質(zhì)譜檢測條件

色譜柱：XSELECT HSS T3柱(100 mm×3.0 mm，3.5 μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序如下：0.00～1.00 min，保持流動相A為70%；1.00～2.00 min，流動相A由70%變?yōu)?0%；2.00～3.00 min，保持流動相A為30%；3.00～4.00 min，流動相A由30%變?yōu)?%；4.00～8.00 min，保持流動相A為5%，流動相B為95%；8.00～8.10 min，流動相A由5%變?yōu)?0%；8.10～10.00 min，保持流動相A為70%。柱溫：30 ℃，流速：0.4 mL/min，進樣量：5 μL。

離子源為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子掃描，以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣及其他適合氣體。電噴霧電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，氣簾氣壓力241 kPa，霧化氣壓力413 kPa，輔助氣壓力344 kPa。羥甲烯龍的定量離子對為m/z333.0/99.0，監(jiān)測離子對為m/z333.0/159.2，去簇電壓140 V，碰撞能量分別為40 eV和30 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜檢測條件優(yōu)化

羥甲烯龍質(zhì)譜檢測條件在Manual Tuning模式下進行優(yōu)化。將1.0 mg/L羥甲烯龍溶液以7 μL/min的速度泵入質(zhì)譜儀中，在Q1 MS模式下尋找母離子，發(fā)現(xiàn)其為m/z333.0；之后對去簇電壓進行優(yōu)化，選擇為140 V；在Product Ion模式下尋找子離子，發(fā)現(xiàn)其子離子包括m/z99.0和159.2，其中m/z99.0強度更高，確定其為定量子離子；在MRM模式下對碰撞能量進行優(yōu)化，確定離子對為m/z333.0/99.0和333.0/159.2的碰撞能量分別為40 eV和30 eV。

2.2 液相分離條件優(yōu)化

采用MRM模式的LC-MS/MS法進行分析時，必須盡可能的防止流動相中共流出物對待測組分的離子抑制作用。本工作比較了XSELECT HSS T3色譜柱、CAPCELL PAK C18 MG色譜柱、ZORBAX SB-C18色譜柱對羥甲烯龍的保留情況。結(jié)果表明，在Waters XSELECT HSS T3色譜柱上羥甲烯龍的保留時間適中、峰形更加尖銳對稱，且與樣品基質(zhì)峰能徹底分離。因此，在后續(xù)檢測中采用該色譜柱進行分離檢測。

羥甲烯龍的色譜檢測條件的優(yōu)化，采用混合畜禽產(chǎn)品基質(zhì)提取液加標至100 ng/mL作為模擬樣品，以監(jiān)測離子對m/z333.0/99.0和333.0/159.2的色譜分離情況為標準，考察不同流動相條件下羥甲烯龍與基質(zhì)峰分離情況，確定了1.3中的色譜分離條件。

2.3 樣品提取條件的選擇

羥甲烯龍在動物體內(nèi)會發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合和硫酸鹽結(jié)合反應(yīng)[1]，因此畜禽產(chǎn)品中羥甲烯龍的測定需要先進行酶解。本工作使用商品化的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶試劑進行酶解[1]。稱取5.0000 g樣品，加入10 mL NaAc-HAc緩沖溶液，渦旋混勻后，加入25 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，再渦旋混和，于37 ℃水浴2 h。

在提取條件的優(yōu)化中，采用混合基質(zhì)樣品進行條件考察，將豬肉、牛肉、羊肉、雞蛋和牛奶樣品進行等分(m/m)混合。

2.3.1 pH的選擇羥甲烯龍的logP值為4.4，pKa為4.5，是具有一定極性的酸性物質(zhì)，因此考慮采用合適的有機溶劑在堿性條件下對其進行萃取。本工作以Na2CO3-NaHCO3緩沖體系為基礎(chǔ)，考察了pH在7～12范圍內(nèi)，羥甲烯龍在不同pH條件下的提取效果，結(jié)果如圖2中所示。結(jié)果表明，羥甲烯龍的提取效率隨著pH的升高而上升，pH=9時基本達到平臺，因此選擇pH=10作為提取的pH。

2.3.2 提取溶劑及體積的選擇實驗比較了乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚作為提取劑對羥甲烯龍?zhí)崛⌒实挠绊?。結(jié)果如圖3中所示，乙醚的提取效率最佳，且在離心分離過程中，水相及有機相分層最為清晰，而二氯甲烷盡管提取效率近似于乙醚，但由于其密度大于水，因此在離心后位于離心管下層，不利于有機相與樣品的分離。因此，實驗采用乙醚為提取溶劑。

考察了5、10、15、20、25和30 mL乙醚用量下羥甲烯龍的提取效果，結(jié)果表明，隨著提取劑使用量的增加，羥甲烯龍的提取效率有所增加，但到15 mL后就不再上升，因此，后續(xù)實驗中采用20 mL乙醚作為提取溶劑。

圖2 不同pH條件對羥甲烯龍的提取影響Fig.2 Effect of pH on the extraction of oxymetholone

圖3 不同提取溶劑對羥甲烯龍的提取影響Fig.3 Effect of extraction solvent on the extraction of oxymetholone

2.3.3 凈化方式考察考慮到畜禽產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，本工作嘗試采用QuEChERS法中常用的吸附劑乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)及石墨化炭黑(GCB)對提取液進行凈化，結(jié)果表明三種吸附劑均對有機提取液中的羥甲烯龍有一定的吸附作用。

隨后考察了固相萃取(SPE)凈化的可行性，對HLB(3 cc/60 mg)和C18(3 mL/100 mg)兩種SPE小柱進行考察。采用HLB和C18小柱對3 mL乙醚提取液進行凈化，1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)洗脫的情況下，HLB對提取液中羥甲烯龍的吸附率為16.2%，C18對提取液中羥甲烯龍的吸附率為17.1%，HLB洗脫后的最終的萃取效率為10.5%，C18洗脫后的最終的萃取效率為10.9%；溶劑置換后采用極性更大的甲醇重溶上樣予以考察，1.0 mL 0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70，V/V)洗脫，該條件下HLB對提取液中羥甲烯龍的吸附率為37.7%，C18對提取液中羥甲烯龍的吸附率為42.5%，HLB洗脫后的最終的萃取效率為31.8%，C18洗脫后最終的萃取效率為34.9%，因此采用SPE雖然能在一定程度上對樣品基質(zhì)進行凈化，但無法滿足對提取液中羥甲烯龍定量萃取的要求。通過LC-MS/MS檢測條件的優(yōu)化，各基質(zhì)加標樣品的提取液直接氮吹重溶后，色譜圖中不會出現(xiàn)明顯的干擾峰。因此本工作最終采用液相萃取、氮吹重溶后直接LC-MS/MS檢測的方法進行羥甲烯龍的分析。

2.4 分析性能考察

在最優(yōu)的實驗條件下，對方法的分析性能進行了考察，檢出限(羥甲烯龍響應(yīng)值為噪聲3倍時的濃度)為0.02 mg/kg，定量限(10倍信噪比)為0.05 mg/kg，線性范圍為0.05～1.0 mg/kg，方法精密度為10.1%(n=7)，線性關(guān)系如表1中所示。不同基質(zhì)中羥甲烯龍加標檢出限濃度的色譜圖如圖4中所示。

目前，羥甲烯龍在食品中尚無限量要求，而WADA對運動員尿樣檢測方法的檢出限為5 ng/mL[3]，考慮到羥甲烯龍隨食物在進入人體后的吸收及排泄有限，本方法可以滿足畜禽產(chǎn)品中羥甲烯龍的日常檢測安全監(jiān)督。

表1 不同樣品中羥甲烯龍的線性關(guān)系Table 1 The linear relationship of oxymetholone in different samples

圖4 不同樣品中羥甲烯龍檢出限濃度的色譜圖Fig.4 Chromatograms of oxymetholone(0.02 mg/kg) in different samples

2.5 實際樣品分析

將本方法應(yīng)用于市售的豬肉、牛肉、羊肉、牛奶及雞蛋樣品中羥甲烯龍的分析，在5種實際樣品中均未檢出羥甲烯龍。因此，采用加標回收實驗驗證本方法的準確性。由表2中結(jié)果可知，在不同樣品中羥甲烯龍的回收率在80.2%～110.0%之間，表明本方法準確性良好，可用于多種動物源性基質(zhì)中羥甲烯龍的分析檢測。

表2 不同樣品中羥甲烯龍的加標回收率(n=7)Table 2 Recoveries of oxymetholone in different samples(n=7)

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3 結(jié)論

本工作建立了適用于多種畜禽產(chǎn)品基質(zhì)中蛋白同化制劑羥甲烯龍的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法的建立填補了目前國家及各行業(yè)標準中蛋白同化制劑羥甲烯龍的檢測空白，有助于運動員食品中食源性興奮劑檢測工作的推進和滿足食品安全監(jiān)督檢測需求。