細(xì)胞色素P450酶CYP3A4與雙酚A的相互作用研究

張文強(qiáng)， 劉紅艷*， 唐 琳， 謝世偉， 易忠勝， 單 楊,2

(1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林 541006； 2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖南農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湖南長(zhǎng)沙 410125)

對(duì)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)有干擾的化學(xué)物質(zhì)(EDCs)通過(guò)各種生產(chǎn)和生活方式排放到環(huán)境中，給環(huán)境和人類的健康帶來(lái)的不利影響早已受到研究人員的關(guān)注[1]。雙酚A(BPA)作為應(yīng)用最廣泛的內(nèi)分泌干擾物之一[2]，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各種聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂等材料，比如飲料瓶，熱敏紙等[3]。此外，也有研究證明BPA也可能存在于化妝品、玩具、醫(yī)療設(shè)備中[4]。BPA具有雌激素效應(yīng)，會(huì)對(duì)不同的組織和器官造成損傷，如生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等[5]。因此BPA與人體之間的相互作用研究受到大家的關(guān)注。

肝臟是人體內(nèi)以代謝功能為主的一個(gè)器官，在肝臟之中有許多代謝酶參與代謝，其中細(xì)胞色素P450酶(CYP)在藥物代謝和外源物質(zhì)的轉(zhuǎn)化中起著重要作用。細(xì)胞色素P450酶的亞家族種類繁多，其中CYP3A亞家族參與了人類的50%以上的藥物代謝[6]。CYP3A4是肝臟和腸道中含量最豐富的CYP酶，具有廣泛的底物特異性，有研究表明它參與了睪酮和硝苯地平等的生物轉(zhuǎn)化[7]。本研究通過(guò)分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)游離態(tài)的CYP3A4及BPA-CYP3A4結(jié)合物進(jìn)行模擬計(jì)算，探究蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的變化情況，利用熒光光譜法、紫外光譜法、紅外光譜法、三維熒光光譜法從不同的角度去驗(yàn)證BPA對(duì)CYP3A4二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響。通過(guò)計(jì)算與光譜研究進(jìn)一步闡明分子之間的結(jié)合機(jī)制，同時(shí)還可以為進(jìn)一步研究細(xì)胞色素P450酶催化轉(zhuǎn)化外源物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和參考信息，并為生物體內(nèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)表達(dá)的酶系轉(zhuǎn)化外源性化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CaryEclipse熒光分光光度計(jì)(美國(guó)，VARIAN公司)；TU-1950紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司)；iS10傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)，Thermo Fisher公司)。

BPA儲(chǔ)備液：先使用少量甲醇溶解BPA(純度99.8%，阿拉丁公司)，后使用Tris-HCl(含0.15 mol/L NaCl)緩沖溶液稀釋為1.0×10-6mol/L儲(chǔ)備液待用。CYP3A4儲(chǔ)備液：使用Tris-HCl(含0.15 mol/L NaCl)緩沖溶液溶解CYP3A4(Biovision公司，USA)，配制為1.0×10-5mol/L儲(chǔ)備液待用。在本實(shí)驗(yàn)中，所用試劑都是分析純，所用水都是二次蒸餾水。

1.2 熒光光譜測(cè)定

分別移取1 mL 1.0×10-6mol/L的CYP3A4溶液于10 mL的比色管中，依次加入不同體積BPA溶液，用pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液定容至10 mL，分別在溫度298 、303、310 K下恒溫10 min后，測(cè)定200～450 nm范圍內(nèi)的熒光光譜變化。激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm。

在室溫條件下，檢測(cè)CYP3A4、CYP3A4與BPA混合液的三維熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)是200～450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)是200～400 nm，激發(fā)與發(fā)射光譜帶寬均為5 nm。

1.3 紫外-可見光譜測(cè)定

在298 K下，分別移取1 mL 1.0×10-6mol/L的CYP3A4溶液于10 mL比色管中，依次加入定量的BPA溶液，用pH=7.4的Tris-HCL緩沖溶液定容至10 mL，恒溫保持10 min，以緩沖溶液作為背景，記錄CYP3A4和BPA混合溶液在190～400 nm之間的紫外-可見光譜。

1.4 紅外光譜測(cè)定

將KBr壓片，使用液體涂膜法對(duì)CYP3A4、CYP3A4和BPA混合溶液進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.5 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)

通過(guò)ChemBioDraw Ultra軟件繪制配體(BPA)小分子結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)Autodock4.2使用拉馬克遺傳算法完成BPA與CYP3A4分子對(duì)接。在對(duì)接過(guò)程中，消除多余的配體和水分子，加點(diǎn)電荷與氫原子，盒子的大小為100 ?×100 ?×100 ?，并進(jìn)行100次對(duì)接計(jì)算。從Bookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)檢索受體(CYP3A4)的晶體結(jié)構(gòu)(4k9t)。使用LigPlus+分析結(jié)合能最低時(shí)的構(gòu)象。使用GROMACS 4.5.5軟件對(duì)BPA與CYP3A4體系進(jìn)行20 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。CYP3A4蛋白經(jīng)過(guò)添加溶劑、建立盒子、添加正(負(fù))離子等一系列處理后，然后用MM-PBSA方法對(duì)BPA-CYP3A4體系進(jìn)行分析計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙酚A與CYP3A4作用的熒光光譜與結(jié)合常數(shù)

圖1A為BPA-CYP3A4的熒光光譜圖。在溫度298、303、310 K下，隨著BPA的濃度升高，BPA-CYP3A4復(fù)合物的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且最大發(fā)射波長(zhǎng)與波峰形狀未發(fā)生改變。這說(shuō)明BPA與CYP3A4發(fā)生了相互作用，并且使復(fù)合物的熒光強(qiáng)度上升。使用熒光增強(qiáng)方程[8]，以1/ΔF對(duì)1/[Q]作雙倒數(shù)曲線圖(圖1B)并通過(guò)計(jì)算BPA與CYP3A4的結(jié)合常數(shù)K得表1。在3個(gè)溫度下，BPA與CYP3A4的雙倒數(shù)曲線呈線性關(guān)系，隨著溫度的上升，結(jié)合常數(shù)K值上升，表明溫度對(duì)其有一定影響。在310 K時(shí)，BPA與CYP3A4的相互作用較強(qiáng)。

圖1 310 K下BPA與CYP3A4(1.0×10-6 mol/L)相互作用的熒光光譜圖(A)與雙倒數(shù)曲線圖(B)Fig.1 Fluorescence spectra of BPA interacted with CYP3A4(1.0×10-6 mol/L) at 310 K and double reciprocal graph of three temperatures A:cBPA(1-9):0-4.5×10-10 mol/L.

2.2 雙酚A與CYP3A4的鍵和模式

不同配體與蛋白的結(jié)合方式不同，通過(guò)計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)，可以判斷其作用力類型，根據(jù)相關(guān)熱力學(xué)公式[9]，計(jì)算BPA與CYP3A4結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)列于表2。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，并結(jié)合表2，ΔG均小于0，表明BPA與CYP3A4的相互作用可以自發(fā)進(jìn)行。ΔS、ΔH大于0，所以在BPA與CYP3A4的相互作用過(guò)程中，疏水作用力起了主要作用。

表1 雙酚A與細(xì)胞色素CYP3A4的結(jié)合常數(shù)Table 1 The binding parameters of BPA with CYP3A4

表2 三個(gè)溫度下的熱力學(xué)常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants at three temperatures

2.3 BPA對(duì)CYP3A4蛋白構(gòu)象的影響

2.3.1 BPA與CYP3A4的紫外吸收光譜蛋白質(zhì)中Trp和Tyr氨基酸殘基的吸光度取決于其發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境，它們向波長(zhǎng)范圍兩側(cè)的偏移(即紅移或藍(lán)移)取決于周圍環(huán)境的極性[11]。圖2為BPA-CYP3A4的紫外吸收光譜，隨著濃度的增加，吸收峰逐漸增強(qiáng)且伴隨輕微的紅移。表明CYP3A4在與BPA進(jìn)行結(jié)合時(shí)，極性增加，吸收峰紅移。此外，二者結(jié)合時(shí)，CYP3A4的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，肽鏈增長(zhǎng)，空間位阻增加，也可導(dǎo)致吸收峰紅移[12]。

2.3.2 紅外光譜圖3為BPA與CYP3A4的紅外光譜圖，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征峰大部分位于1 600～1 700 cm-1區(qū)間。其中1 610～1 640 cm-1為β-折疊，1 640～1 650 cm-1為無(wú)規(guī)則卷曲，1 650～1 658 cm-1為α-螺旋，1 660～1 680 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 680～1 692 cm-1為β-反向平行[13]。使用去卷積與曲線擬合對(duì)紅外譜圖1 600～1 700 cm-1區(qū)間進(jìn)行處理，根據(jù)積分面積分析計(jì)算各個(gè)構(gòu)型在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占相對(duì)百分比。CYP3A4與BPA發(fā)生相互作用后，經(jīng)過(guò)作用前后的分峰擬合結(jié)果分析得到，β-折疊百分比含量從1.28%上升到了1.46%；無(wú)規(guī)則卷曲的百分比含量從16.75%降到了14.36%；α-螺旋百分比含量從62.20%下降至58.63%；β-轉(zhuǎn)角的百分比含量17.36%上升到22.93%；β-反向平行的百分比含量從2.41%上升到了2.62%。由此可以說(shuō)明兩者發(fā)生了相互作用。在圖3中可以看到峰的位移和強(qiáng)度都發(fā)生了改變，和分峰擬合圖相互印證了CYP3A4在與BPA發(fā)生相互作用后，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的改變。

圖2 BPA與CYP3A4相互作用的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of BPA interacted with CYP3A4(1.0×10-6 mol/L) cBPA(1-9):0.5×10-10-4.5×10-10 mol/L.

圖4 CYP3A4(1.0×10-6 mol/L)(A)和BPA-CYP3A4復(fù)合物(1.0×10-6 mol/L)(B)的三維熒光光譜圖Fig.4 Three-dimensional fluorescence spectra of free CYP3A4(1.0×10-6 mol/L) (A) and BPA-CYP3A4 complexes(1.0×10-6 mol/L)

2.3.3 三維熒光光譜圖4顯示了游離態(tài)CYP3A4(圖4(A))和BPA-CYP3A4復(fù)合物(圖4(B))的三維熒光光譜,將瑞利散射峰屏蔽進(jìn)行分析。由圖可知，在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm、發(fā)射波長(zhǎng)340 nm處與激發(fā)波長(zhǎng)225 nm、發(fā)射波長(zhǎng)345 nm處出現(xiàn)兩個(gè)熒光峰，隨著BPA濃度增加，225/345 nm處熒光峰強(qiáng)度由2 109升至2 506，280/340 nm處熒光峰強(qiáng)度從2 419升至3 098，且均有紅移現(xiàn)象。結(jié)果表明，在BPA和CYP3A4結(jié)合過(guò)程中，在Trp和Tyr氨基酸殘基附近的微環(huán)境發(fā)生了改變，結(jié)果與紅外光譜結(jié)果一致。

2.4 分子對(duì)接

分子對(duì)接技術(shù)是可以將配體與受體迅速進(jìn)行結(jié)合的模擬技術(shù)[14]，使用AutoDock對(duì)BPA與CYP3A4進(jìn)行分子對(duì)接。由圖5可知：BPA與CYP3A4在Arg105附近的空腔進(jìn)行了結(jié)合，最佳結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能為-8.0 kcal/mol。在結(jié)合位點(diǎn)處，BPA周圍氨基酸殘基分別為：Arg105、Ile118、Ser119、Arg130、Phe137、Ile301、Phe302、Arg440、Cys442、Ile443、Gly444。這些氨基酸殘基形成了對(duì)接空腔，將BPA包裹在其中。根據(jù)熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，在相互作用中，疏水作用力為主要作用力。在對(duì)接空腔位置，Ile118、Phe137、Ile301、Phe302、Ile443為疏水性氨基酸，提供疏水作用力。另外在對(duì)接位置還存在一個(gè)氫鍵，由Arg130殘基與BPA形成，為N-O組成的氫鍵，距離為2.89 ?。根據(jù)熒光光譜結(jié)果可知，在BPA與CYP3A4的結(jié)合過(guò)程中疏水作用力為主要作用力，從分子對(duì)接中可以看到：除了疏水作用力外，還存在氫鍵作用力。

圖5 BPA與CYP3A4的相互作用的分子對(duì)接與睫毛圖Fig.5 Molecular docking and LigPlus+ graph of the interaction of BPA and CYP3A4

2.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬

圖6為分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果分析圖。從圖6(A)中可以看出，復(fù)合物BPA-CYP3A4的均方根偏差(RMSD)比游離態(tài)CYP3A4的RMSD低，說(shuō)明在結(jié)合過(guò)程中蛋白質(zhì)收縮，CYP3A4和BPA形成的復(fù)合物較為穩(wěn)定。均方根波動(dòng)(RMSF)是基于殘基分析來(lái)觀察蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的柔性變化情況，由圖6(B)中分析得：第130、240、442氨基酸殘基附近發(fā)生了較大變化，驗(yàn)證了分子對(duì)接結(jié)果的準(zhǔn)確性，即隨著CYP3A4與BPA的相互結(jié)合，BPA改變了氨基酸殘基附近的微環(huán)境，使之產(chǎn)生了較大的變化?；匦霃?Rg)用來(lái)分析蛋白整體結(jié)構(gòu)的緊密程度，從圖6(C)可以看出，在前10 ns，CYP3A4及BPA-CYP3A4復(fù)合物的回旋半徑圖譜基本一致，而10 ns之后二者之間的回旋半徑發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明BPA與CYP3A4產(chǎn)生了相互作用，使得CYP3A4的整體結(jié)構(gòu)變得更加緊湊，回旋半徑減小。

圖6 游離態(tài)CYP3A4與復(fù)合物BPA-CYP3A4的RMSF(A)、RMSD(B)和Rg(C)Fig.6 Root mean square fluctuation(RMSF)(A)，root-mean-square displacement(RMSD)(B) and Rg(C) of free CYP3A4 and BPA-CYP3A4 complexes from 10 ns of MD simulations

3 結(jié)論

本研究通過(guò)光譜法和計(jì)算模擬方法證明了CYP3A4和BPA能發(fā)生相互作用，并進(jìn)一步研究了兩者的結(jié)合特征。結(jié)果表明，BPA使CYP3A4發(fā)生了熒光增強(qiáng)，且疏水作用為主要作用力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，BPA-CYP3A4復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)與游離的CYP3A4相比均發(fā)生了改變。另外，對(duì)接空腔位于Arg130殘基附近，由Arg130殘基與BPA形成。在CYP3A4和BPA結(jié)合的過(guò)程中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生收縮，有利于兩者結(jié)合。