基于羅丹明-高半胱氨酸熒光探針對(duì)Hg2+的檢測

李愛玲， 趙秋媛， 王紅斌， 周麗波， 張艷麗， 譚 偉*， 張麗珠

(1.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南昆明 650500； 2.云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，云南昆明 650500)

汞是一種被廣泛使用的重金屬，在日光燈、電腦、移動(dòng)電話和日常電池等日常產(chǎn)品中，都不同程度的使用了含汞材料[1]。Hg2+具有高腐蝕性和致癌性，是常見的環(huán)境污染物之一[2]。人體內(nèi)微量汞的累積不能通過自身的新陳代謝來排泄，這將直接導(dǎo)致心臟、肝臟和甲狀腺疾病，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)崩潰，慢性汞中毒，甚至導(dǎo)致惡性腫瘤的形成[3]。由于它的持久性、可移植性和高生物濃縮性，其最終會(huì)對(duì)人體造成極大的傷害[4]。因此，建立一種簡便、快速、靈敏的Hg2+檢測方法具有重要的實(shí)用價(jià)值[5]。

目前，檢測Hg2+的方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、發(fā)射光譜法(OES)、原子吸收光譜法(AAS)和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)等[6,7]。然而，這些方法都需要昂貴的儀器，復(fù)雜的樣品前處理步驟等。熒光探針技術(shù)具有選擇性專一，靈敏度高、速度快、操作簡單等特點(diǎn)[8,9]。目前，有較多關(guān)于Hg2+熒光探針的報(bào)道[10]。羅丹明衍生物(Rh6G2)具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性、高熒光量子產(chǎn)率[11]等優(yōu)點(diǎn)，其獨(dú)特的螺環(huán)結(jié)構(gòu)和熒光特性在金屬離子探針的設(shè)計(jì)過程中起著重要的作用。在特定金屬離子誘導(dǎo)下，羅丹明內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生開環(huán)，并伴隨著溶液由無色變?yōu)榉奂t色和熒光增強(qiáng)現(xiàn)象?；赗h6G2熒光探針具有良好的光物理性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境化學(xué)等領(lǐng)域[12，13]。

本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)探針Hcy-Rh6G2在Tris-HCl緩沖體系中對(duì)Cu2+有很好的識(shí)別效果，但對(duì)Hg2+響應(yīng)較差[14]?；诖?，本文進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)探針Hcy-Rh6G2在 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖體系中對(duì)Hg2+具有識(shí)別效果好的特性，據(jù)此建立了探針Hcy-Rh6G2對(duì)Hg2+的熒光測試方法，并利用探針Hcy-Rh6G2對(duì)昆明某河的實(shí)際水樣進(jìn)行了測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

5J1-004F-7000熒光分光光度計(jì)(日本，Hitachi)；MR Hei-Tec電磁加熱攪拌器(廣州得翔科技有限公司)；EF20 pH酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

高半胱氨酸(Hcy)(>90%,生化試劑)、羅丹明6G(Rh6G)(95%,分析純)、水合肼(80%,分析純)、二氯甲烷、乙酸乙酯、NaH2PO4(分析純)、Na2HPO4(分析純)、Al2O3(分析純)，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(分析純，Shanghai Mackin Biochemical)。

1.2 探針制備及熒光光譜測試

探針分子Hcy-Rh6G2按課題組前期報(bào)道的方法[14]合成。在甲醇和HEPES(1∶1)體系中，分別測定Hcy-Rh6G2和Hcy-Rh6G2+Hg2+兩個(gè)體系的熒光光譜。熒光光譜測試條件為：激發(fā)波長510 nm，發(fā)射波長520 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm。

1.3 實(shí)際水樣的檢測

為了探究探針分子Hcy-Rh6G2對(duì)實(shí)際水樣中Hg2+的檢測，實(shí)驗(yàn)取昆明撈魚河中的水樣進(jìn)行測定。在兩個(gè)水樣中分別加入濃度為0.12、0.2 mmol/L Hg2+，平行測定3次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針熒光光譜性能測試

在甲醇和HEPES(1∶1)體系中，將30 μL 0.1 mol/L Hg2+加入4 mL 0.1 mmol/L探針Hcy-Rh6G2溶液中。探針Hcy-Rh6G2和Hcy-Rh6G2+Hg2+體系熒光光譜測試結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，Hcy-Rh6G2熒光較弱，加入Hg2+后，在最大吸收波長為553 nm處的熒光強(qiáng)度為24.17。表明加入Hg2+能導(dǎo)致探針Hcy-Rh6G2熒光增強(qiáng)，從而建立一種檢測Hg2+的方法。

2.2 溶液pH對(duì)探針Hcy-Rh6G2熒光光譜的影響

為了探究pH對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響情況，用0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH，在甲醇和HEPES(1∶1)的體系中，將2 mL 0.1 mol/L Hcy-Rh6G2溶液加到不同pH(1.0～12.0)的溶液中。探針熒光強(qiáng)度隨pH變化如圖2所示。從圖可以看出，在pH=6.2～12.0范圍內(nèi)，探針的熒光強(qiáng)度受pH的影響較小，當(dāng)pH從6.2降至1.0時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度隨pH值減小而增強(qiáng)，說明探針在pH為6.2～12.0的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，其熒光強(qiáng)度較低，具有較小的背景值。其可能的原因是探針分子內(nèi)酰胺環(huán)在堿性條件下是較為穩(wěn)定成閉環(huán)狀態(tài)，在酸性較強(qiáng)的溶液中產(chǎn)生開環(huán)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。

圖1 Hcy-Rh6G2和Hcy-Rh6G2+Hg2+的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of probe Hcy-Rh6G2 and probe Hcy-Rh6G2+Hg2+ [Hcy-Rh6G2]=1.0×10-4 mol/L,[Hg2+]=0.1 mol/L,pH=7.0.

圖2 探針Hcy-Rh6G2的熒光強(qiáng)度與pH關(guān)系曲線Fig.2 Fluorescence intensity-pH curve of probe Hcy-Rh6G2

圖3 不同金屬離子對(duì)探針Hcy-Rh6G2熒光光譜的影響Fig.3 Effect of different metal ions on fluorescence spectra of probe Hcy-Rh6G2 [Hg2+]=0.1 mol/L,VCH3OH∶VHEPES=1∶1,pH=7.0.

2.3 探針Hcy-Rh6G2的選擇性實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步研究探針在HEPES體系中對(duì)Hg2+的選擇性識(shí)別，分別將探針溶液加入到金屬離子Na+、Ni2+、Fe2+、Hg2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Al3+、Cu2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、K+、Mn2+溶液中，測定其熒光強(qiáng)度。探針的離子選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，探針Hcy-Rh6G2對(duì)Hg2+的熒光響應(yīng)最好，說明探針Hcy-Rh6G2對(duì)Hg2+具有較好的專一識(shí)別性能。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

圖4 (a)常見陽離子對(duì)Hg2+識(shí)別的干擾；(b)常見陰離子對(duì)Hg2+識(shí)別的干擾Fig.4 (a) Interference of common cations on Hg2+ recognition;(b) interference of common anions on Hg2+ recognition

2.5 分析性能

為了考察Hcy-Rh6G2探針對(duì)Hg2+濃度滴定的影響，當(dāng)探針的濃度為1.0×10-4mol/L時(shí)，向其中加入不同濃度的Hg2+(0～7.50×10-4mol/L)，其熒光光譜如圖5(a)所示。從圖中可以看出，Hg2+濃度小于3.0×10-4mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，Hg2+濃度大于3.0×10-4mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于平緩。在波長555 nm處的熒光強(qiáng)度隨Hg2+濃度增加的熒光曲線如圖5(b)所示，Hg2+濃度在2.50×10-5～2.25×10-4mol/L范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度呈線性關(guān)系，其回歸方程為：y=1.6698x-5.4375，相關(guān)系數(shù)R=0.9799，檢出限為6.19×10-6mol/L。

圖5 (a)Hg2+濃度變化與探針Hcy-Rh6G2相互作用的熒光滴定曲線；(b)探針Hcy-Rh6G2的熒光強(qiáng)度隨Hg2+濃度變化的線性關(guān)系圖Fig.5 (a)Fluorometric titration curves of interaction between Hg2+ concentration and probe Hcy-Rh6G2；(b) Linear relationship between the fluorescence intensity of probe Hcy-Rh6G2 and the concentration of Hg2+

2.6 檢測機(jī)理研究

為了探究探針Hcy-Rh6G2和Hg2+的反應(yīng)機(jī)制，先將12 μL 0.1 mol/L Hg2+加入到探針溶液中反應(yīng)24 h，再加入24 μL 0.1 mol/L EDTA，測定其熒光光譜，結(jié)果如圖6(a)所示，探針識(shí)別Hg2+后可能存在的副產(chǎn)物質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖6(b)所示。從圖6(a)可以看出，當(dāng)加入對(duì)Hg2+絡(luò)合較強(qiáng)的EDTA 后，未對(duì)其熒光產(chǎn)生明顯影響，說明Hcy-Rh6G2對(duì)Hg2+的識(shí)別過程不可逆且結(jié)合較為緊密。檢測反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物的質(zhì)譜分析(Q-TOF-MS)：([M+H])理論值：415.20m/z，實(shí)測值：415.2015m/z，判斷產(chǎn)生了RCOOH，可能的原因是發(fā)生了水解反應(yīng)。推斷Hcy-Rh6G2探針對(duì)Hg2+的識(shí)別機(jī)理如圖7所示。

圖6 (a)過量EDTA濃度下Hcy-Rh6G2-Hg2+的熒光光譜；(b)Hcy-Rh6G2+Hg2+的質(zhì)譜圖Fig.6 (a) Fluorescence spectra of Hcy-Rh6G2-Hg2+ at excessive EDTA concentration([Hcy-Rh6G2] = 1.0×10-4 mol/L,[Hg2+]=0.1 mol/L)；(b)Mass spectrum of Hcy-Rh6G2+Hg2+

圖7 探針Hcy-Rh6G2與Hg2+的反應(yīng)機(jī)理Fig.7 Reaction mechanism of probe Hcy-Rh6G2 and Hg2+

2.7 實(shí)際水樣分析

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法研究探針對(duì)昆明撈魚河水樣中Hg2+的檢測情況，結(jié)果如表1所示。Hg2+添加濃度范圍為0.12～0.2 mmol/L，回收率為97.0%～98.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.34%～0.57%。分析結(jié)果可靠，可用于實(shí)際水樣中Hg2+的檢測。

表1 實(shí)際水樣中Hg2+的測定結(jié)果(n=3)Table 1 Determination of Hg2+ in actual water samples(n=3)

3 結(jié)論

建立了一種利用探針Hcy-Rh6G2對(duì)Hg2+的熒光檢測方法。研究結(jié)果表明，探針分子Hcy-Rh6G2可以在HEPES緩沖溶液中快速、選擇性的識(shí)別Hg2+，當(dāng)Hg2+濃度在2.50×10-5～2.25×10-4mol/L范圍內(nèi)，Hcy-Rh6G2熒光探針對(duì)Hg2+具有較好的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)探究了探針對(duì)Hg2+檢測機(jī)理，結(jié)果顯示可能為水解反應(yīng)。