ω-3 PUFAs對小鼠炎癥性腸病調(diào)節(jié)性T細胞影響的研究

馮曉玲 高鴻亮

炎癥性腸?。╥nf lammatory bowel disease，IBD）分為潰瘍性結(jié)腸炎與克羅恩病，是特發(fā)性腸道炎癥疾病，具有發(fā)病早、病程緩和易復(fù)發(fā)特點，患者發(fā)病后需要接受長時間治療，嚴重影響患者正常生活[1]。目前僅了解IBD 發(fā)病主要由遺傳、腸道細菌、環(huán)境以及腸道免疫系統(tǒng)失調(diào)等眾多因素一同導(dǎo)致[2]。炎癥反應(yīng)過程與機體免疫系統(tǒng)功能關(guān)系密切，探究腸道炎癥發(fā)生時機體免疫功能變化對于了解腸道炎癥疾病合理免疫治療方案制定具有重要意義。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）可通過細胞之間相互作用與因子釋放達到減少輔助T細胞增殖、抑制促炎因子分泌、減少免疫損傷和鞏固免疫耐受的目的[3]。ω-3 多不飽和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs）作為人體正常運轉(zhuǎn)必需脂肪酸之一，其主要由二十碳五烯酸與二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）組成，不僅可以為機體提供能量，還可以作為藥物治療自身免疫性疾病，甚至能夠抑制T細胞及淋巴細胞增殖[4]。本研究以IBD 小鼠為模型，進一步明確ω-3 PUFAs對IBDTreg細胞的影響。

材料和方法

一、材料

1.動物和試劑：小鼠來自新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院動物研究中心，三硝基苯磺酸、維甲酸（美國Sigma公司），ω-3 PUFAs、DHA、飽和脂肪酸硬脂酸（美國Peprotech公司），RPMI- 1640 培養(yǎng)基、PBS 磷酸鹽緩沖液（上海士峰生物科技有效公司），胎牛血清（美國Thermo Scientif ic公司），annexinV- FITC 凋亡檢測試劑盒（上海碧云天公司），F(xiàn)ITC- anti-CD4、

PE- ant- CTLA- 4、APC-anti-Foxp3、PE-anti- CD39、PE- anti- CD25、anti-CD3、anti-CD28 單克隆抗體、固定/通透液、高爾基體阻斷劑BD Golgistop 蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑（丹麥eBioscience公司），鼠CD4+CD25+Treg 分離試劑盒（上海強智生物科技有限公司），TGF-β、IL-2（南京歐凱生物公司），CFSE 及anti-CD3/CD28 beats（美國Gibcolifetechnologies 公司），白介素-10（IL-10）、Foxp3 以及干擾素-γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國Invitrogen公司）。

2.儀器：FYL-YS-150L型號細胞培養(yǎng)箱（中國北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司），MA100型號倒置顯微鏡（日本尼康公司），LDZ5-2型號離心機（中國北京時代北利離心機有限公司），Accuri C6型號流式細胞儀（美國BD公司）。

二、方法

1.動物分組以及處理：120 只雄性健康Balb/C小鼠均為SPF級別，5～9 周齡，平均為（6.14±0.82）周，體質(zhì)量17～22 g，平均（20.51±0.47）g，小鼠均給予質(zhì)量體積為1%三硝基甲苯30%乙醇溶液處理，以形成IBD 小鼠模型，三硝基甲苯乙醇溶液處理濃度為100 mg/kg。隨后將所有小鼠按照隨機數(shù)字表分組方法分為4 組，分別以2.5g/（kg·d）濃度腹腔注射ω-3 PUFAs（ω-3 PUFAs組）、飽和脂肪酸硬脂酸（硬脂酸對照組）、DHA（DHA 組），同時設(shè)置注入相同濃度生理鹽水作為空白對照組，隨后小鼠均連續(xù)注入14 d。14 d后將小鼠處死，部分結(jié)腸采用甲醛固定用于組織學(xué)分析，部分則用于Treg細胞功能檢測。

2.組織學(xué)分析：結(jié)腸組織應(yīng)用10%甲醛固定后進行脫水、石蠟包埋、切片以及染色處理，最后采用相關(guān)文獻[5]進行評分以及組織學(xué)分析。

3.Treg細胞水平測定：小鼠結(jié)腸組織研磨后應(yīng)用100 目篩網(wǎng)過濾后獲取細胞懸液，隨后經(jīng)由裂解后離心并采用PBS 清洗3次，調(diào)節(jié)細胞濃度為6×105個/mL，添加PE-CD25 抗體，在4℃環(huán)境下進行避光孵育30 min。胞內(nèi)細胞因子染色分析需要在培養(yǎng)完成4～6 h 給予蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑以阻斷處理，添加標準為含有106個細胞2 mL 培養(yǎng)液需要添加4 μL 蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑。避光孵育結(jié)束后采用PBS 進行1～2次洗滌后應(yīng)用200 μL 固定/通透液處理，此過程需要在4℃環(huán)境下避光30 min，結(jié)束后應(yīng)用通透洗滌液進行2次洗滌，采用通透液（100 μL）重懸，并加入細胞因子與表型分析抗體PE- anti- Foxp3，同樣在4℃環(huán)境下避光孵育30 min，結(jié)束后應(yīng)用通透液洗滌，最終采用PBS（200 μL）重懸后選擇流式細胞儀予以檢查并分析。

4.細胞內(nèi)因子mRNA表達水平測定：檢測使用Real- time PCR，應(yīng)用Trizol 法對nTregs 與iTregs細胞總RNA 進行抽提與純化，隨后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其作為模板予以PCR 擴增。Real-time PCR 操作參照對應(yīng)試劑盒說明書進行，1 μL cDNA 對應(yīng)10 μL PCR 引物，反應(yīng)條件設(shè)置為95℃進行預(yù)變性，時間為30 s，95℃持續(xù)30 s，最終為60℃ 30 s，一共40個循環(huán)。內(nèi)參選擇GAPDH，并應(yīng)用 2-ΔΔCT計算對應(yīng)細胞因子mRNA表達水平。所用引物序列見表1。

表1 引物序列信息

5.細胞因子水平測定：將小鼠結(jié)腸組織制成組織勻漿，隨后采用酶聯(lián)免疫吸附法測定上清液中IL- 10、Foxp3 以及IFN-γ 水平，檢測按照對應(yīng)試劑盒進行操作。

6.觀察指標：比較各組小鼠組織學(xué)評分，Treg細胞表型，細胞內(nèi)部因子mRNA表達水平，上清液中細胞因子水平。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS20.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料如小鼠組織學(xué)評分、Treg細胞表型比例、細胞內(nèi)部因子mRNA表達水平、上清液中細胞因子水平均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差比較，兩兩比較應(yīng)用SNK 檢驗，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠結(jié)腸組織組織學(xué)分析

空白對照組小鼠結(jié)腸觀察到顯著水腫、充血和糜爛，上皮細胞可以觀察到明顯潰瘍以及壞死，有明顯淋巴細胞以及中性粒細胞浸潤，硬脂酸對照組、DHA 組與ω-3 PUFAs組炎癥細胞浸潤程度逐漸減輕，可以觀察到少量淋巴組織增生周圍組織可見明顯黏連（圖1）。與空白對照組比較，硬脂酸對照組、DHA 組與ω-3 PUFAs組小鼠組織學(xué)評分 [（4.12±0.89）分 比（3.82±0.51）分、（2.51±0.74）分、（1.04±0.36）分]均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 137.469，P＜ 0.05），各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），僅空白對照組與硬脂酸組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

二、各組Treg細胞表型比例比較

與空白對照組比較，硬脂酸對照組、DHA組與ω-3 PUFAs組Treg細胞表型比例[（3.80±0.89）%比（3.90±0.75）%、（7.22±1.13）%、（10.10±1.29）%] 均升高，與空白對照組比較，硬脂酸對照組、DHA 組以及ω-3 PUFAs組Treg細胞表型比例升高，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（F= 304.301，P＜0.05），各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），其中僅空白對照組與硬脂酸對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05，圖2）。

三、各組細胞內(nèi)部因子mRNA表達水平比較

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察四組小鼠結(jié)腸組織病理情況（HE染色，×400）

圖2 四組Tr eg細胞表型檢測

與空白對照組比較，ω-3 PUFAs組、硬脂酸對照組、DHA 組細胞內(nèi)部Foxp3、IL-10 mRNA表達水平均升高（P＜ 0.05），與硬脂酸對照組比較，ω-3 PUFAs組 與DHA 組 細 胞 內(nèi) 部Foxp3、IL-10 mRNA表 達水平均升高，且ω-3 PUFAs組高于DHA 組（P均＜0.05，表1）。

表1 各組細胞內(nèi)部因子mRNA表達水平比較（± s）

表1 各組細胞內(nèi)部因子mRNA表達水平比較（± s）

注：與空白對照組比較，aP ＜ 0.05，與硬脂酸對照組比較，bP ＜ 0.05，與DHA 組比較，cP ＜ 0.05

分組例數(shù) Foxp3 IL-10空白對照組 30 96.74 ± 6.65 0.59 ± 0.18硬脂酸對照組 30 107.33 ± 6.82a 0.98 ± 0.29a DHA 組 30 122.67 ± 8.53ab 1.22 ± 0.59ab ω-3 PUFAs組 30 165.22 ± 10.43abc 1.47 ± 0.53abc F 值 399.211 22.584 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

四、各組上清液中細胞因子水平比較

與空白對照組比較，ω-3 PUFAs組、硬脂酸對照組、DHA 組上清液中細胞因子IL-10、Foxp3 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05），與硬脂酸對照組比較，ω-3 PUFAs組與DHA 組上清液中細胞因子IL-10、Foxp3 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05），與DHA 組 比較，ω-3 PUFAs組上清液中IL-10、Foxp3 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05，表2）。

表2 各組上清液中細胞因子水平比較（± s）

表2 各組上清液中細胞因子水平比較（± s）

注：與空白對照組比較，aP ＜ 0.05；與硬脂酸對照組比較，bP ＜ 0.05；與DHA 組比較，cP ＜ 0.05

分組例數(shù) IL-10（pg/mL）Foxp3（ng/mL）IFN-γ（pg/mL）空白對照組 30 83.51± 4.67 9.65 ± 1.29 203.51 ± 10.29硬脂酸對照組 30 108.35 ± 7.22a 13.73 ± 1.32a 165.32 ± 11.67a DHA 組 30 122.29 ± 15.33ab 15.67 ± 2.57ab 128.34 ± 6.77ab ω-3 PUFAs組 30 153.67 ± 15.28abc 19.53 ± 2.18abc 105.29 ± 6.81abc F 值 189.451 137.366 665.863 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

討 論

IBD 為胃腸道組織出現(xiàn)慢性炎癥性疾病，目前認為其發(fā)病主要由胃腸道免疫功能損傷以及黏膜反應(yīng)過度所致。已有研究證實Treg細胞是保證機體免疫耐受的重要細胞，其功能障礙或者數(shù)量減少會導(dǎo)致IBD 發(fā)生[7]。動物實驗更是進一步證實將CD4+CD25-T 淋巴細胞轉(zhuǎn)移至T 淋巴功能障礙小鼠體內(nèi)，會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)一系列自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IBD 等，而將CD4+CD25+T 淋巴細胞轉(zhuǎn)移給同樣小鼠，其免疫缺陷疾病則可以有效避免[8]。因此，IBD 治療應(yīng)以糾正患者免疫功能紊亂，改善Treg細胞水平為主。

ω-3PUFAs 主要由EPA 與DHA 組成，其中EPA可以有效促進抗炎細胞因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)過度，改善免疫功能，DHA 為膜磷脂形成重要組成，對細胞膜具有保護穩(wěn)定作用[9]。研究顯示癌癥患者Treg細胞水平異常上升，患者通過攝入ω-3PUFAs可以抑制Tregs細胞功能，減少細胞對免疫抑制相關(guān)因子釋放，間接改善B細胞、抗原呈遞細胞以及CD8+細胞功能，糾正機體免疫紊亂達到抗腫瘤作用[10]。IBD 發(fā)病則主要是由Tregs細胞減少以及功能異常所致，所以其治療應(yīng)以促進Treg細胞成熟與分化，改善其功能為主。已有研究證實IBD患者外周血Treg細胞水平明顯少于健康者，而在炎癥恢復(fù)期患者Treg細胞水平與健康者差異逐漸減少，顯示患者炎癥緩解主要為Tregs細胞被募集至炎癥位置發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11]。Foxp3 是反映Tregs細胞功能成熟作用特異性標記物，Treg細胞逐漸增加結(jié)直腸癌患者病灶組織中Foxp3+Tregs表達增加，而攝入高劑量ω-3PUFAs 結(jié)直腸癌患者Foxp3+Tregs表達水平有效降低，顯示ω-3PUFAs 可以通過Foxp3 介導(dǎo)Tregs細胞免疫調(diào)節(jié)作用[12]。本研究中ω-3 PUFAs組與DHA 組Treg細胞表型比例高于硬脂酸對照組與空白對照組，顯示IBD患者體內(nèi)Tregs細胞減少，而使用ω-3 PUFAs 以及DHA 處理后，Tregs細胞水平有效改善。正常情況下腸道菌群處于平衡狀態(tài)，這種平衡作用主要由Tregs/Th17細胞調(diào)節(jié)，炎癥性腸炎發(fā)生時，Treg細胞減少，機體免疫調(diào)節(jié)作用紊亂；而ω-3PUFAs 處理后可以從改善細胞內(nèi)部脂肪酸代謝、細胞膜磷脂水平、調(diào)節(jié)氧化酶作用以及影響細胞膜流動性等多方面調(diào)節(jié)機體腸道免疫作用，減輕腸道炎癥[13-14]。

胃腸道Treg細胞與腸道菌群關(guān)系密切，腸道菌群清除小鼠Tregs細胞數(shù)量減少，而腸道菌群代謝產(chǎn)物可以有效上調(diào)Treg細胞數(shù)量以及IL-10 達到減輕腸道炎癥目的[15]，進一步顯示Treg細胞及其分泌細胞因子在腸道免疫功能以及炎癥反應(yīng)過程中作用重大。本研究中ω-3 PUFAs組、硬脂酸對照組、DHA 組細胞內(nèi)部Foxp3、IL-10 mRNA表達水平均高于空白對照組，ω-3 PUFAs組與DHA 組細胞內(nèi)部Foxp3、IL-10 mRNA表達水平高于硬脂酸對照組，顯示添加脂肪酸可以有效調(diào)節(jié)Foxp3、IL-10表達，而ω-3PUFAs 有效成分EPA 與DHA 對Foxp3、IL-10表達調(diào)節(jié)作用更顯著。Foxp3 作為Tregs細胞特異性標志物，其mRNA表達水平變化顯示了Tregs細胞功能變化，Tregs細胞進行免疫調(diào)節(jié)作用主要由其分泌細胞因子IL-10、IFN-γ 等以及細胞接觸期間細胞毒性T 淋巴細胞抗原-4 信號傳遞發(fā)揮作用，IL-10 作為抑制炎癥細胞因子，在IBD 中具有顯著免疫抑制以及抗炎作用[16-17]。其后分析上清液中炎癥因子水平發(fā)現(xiàn)，脂肪酸尤其是ω-3 PUFAs 與DHA 處理后上清液中細胞因子IL-10、Foxp3 水平顯著增加，IFN-γ 水平顯著下降，由此本研究推測，ω-3PUFAs 通過刺激Foxp3 以及IL-10 水平增加，刺激CD4+CD25-Tregs細胞向Tregs細胞轉(zhuǎn)化，增加IL- 10、Foxp3 水平，下調(diào)IFN-γ 水平，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，緩解炎癥。

綜上，ω-3PUFAs 可以通過激活Tregs細胞，釋放抑炎細胞因子，下調(diào)促炎細胞因子水平達到糾正IBD 小鼠紊亂免疫應(yīng)激，減輕炎癥作用，其有望為IBD 治療提供新思路。