肝細(xì)胞生長因子基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝損傷的研究進(jìn)展

修文麗 毛成剛 楊晨宇 董蒨

肝損傷修復(fù)是指肝臟受到各種病理性因素（如感染、藥物、毒物、手術(shù)和外傷等）刺激后，肝臟細(xì)胞受到破壞，繼而機(jī)體啟動(dòng)損傷修復(fù)機(jī)制的過程。在此過程中，肝內(nèi)炎癥的過度反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞過度凋亡和組織纖維化等，均可導(dǎo)致肝組織壞死、結(jié)構(gòu)異常。嚴(yán)重者肝臟纖維結(jié)締組織繼續(xù)增生，假小葉形成，肝臟纖維化，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化，最終不可逆地走向肝衰竭[1]。盡管目前內(nèi)科領(lǐng)域有各種保肝藥物的研發(fā)應(yīng)用，外科領(lǐng)域有計(jì)算機(jī)輔助手術(shù)系統(tǒng)更加精準(zhǔn)指導(dǎo)手術(shù)[2-3]，但減輕肝臟損傷、促進(jìn)肝臟修復(fù)和再生、阻止肝纖維化始終是肝損傷治療研究中的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesench ymal stem cells，MSCs）是一類能進(jìn)行自我復(fù)制更新、具有分化為多種組織細(xì)胞潛能的干細(xì)胞，來源廣泛，是目前進(jìn)行基因改造優(yōu)選的明星干細(xì)胞。MSCs 可旁分泌多種細(xì)胞因子，肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是其中重要的一種，可發(fā)揮促進(jìn)肝細(xì)胞DNA 合成、有絲分裂、抑制凋亡，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管再生，減輕組織纖維化等生物學(xué)效應(yīng)。隨著近年來對(duì)MSCs 研究的愈加深入，發(fā)現(xiàn)HGF 基因修飾的MSCs（HGF-MSCs）對(duì)肝損傷的治療能夠發(fā)揮更大的效果，本文就此展開綜述。

一、MSCs

MSCs 是一種來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層干細(xì)胞，擁有自我復(fù)制更新和多向分化潛能[4]。它廣泛分布于骨髓、臍帶和脂肪等多種組織和器官中。國際細(xì)胞治療組織（International Society for Cellular Therapy）對(duì)鑒定人的MSCs提出了以下3 點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)[5]：（1）在標(biāo)準(zhǔn)且適宜的培養(yǎng)條件下，必須貼壁生長；（2）細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)CD105+/CD73+/CD90+，同時(shí)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD34、CD45、CD11a、CD19 和人類白細(xì)胞抗原-DR 等陰性表達(dá)；（3）在體外經(jīng)特殊條件誘導(dǎo)，能分化為機(jī)體多種細(xì)胞（如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞等）。MSCs 除具有以上所述的生物學(xué)特性外，還具有來源途徑廣泛、類型多樣、表面抗原性弱、免疫原性低和致瘤性極低等優(yōu)勢(shì)，從而使MSCs 具有廣闊的發(fā)展前景。

在肝臟研究方面，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同組織來源的MSCs 不僅形態(tài)和表型相似，而且都具備向功能性肝細(xì)胞分化的潛能[6]。MSCs 移植入肝臟受損的動(dòng)物或人體內(nèi)，可定植于受損肝組織，分化為正常肝臟細(xì)胞并在一定程 度上取代受損細(xì)胞[7-8]，并且旁分泌大量細(xì)胞因子[9]，通過多種信號(hào)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管再生，減輕纖維化[10-13]，從而為肝臟疾病開辟了新的治療思路和途徑。

隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)移植后損傷部位的MSCs存活率低、分化效率低，單純依靠MSCs對(duì)肝損傷的治療作用有限。但是增加MSCs 的移植劑量可能會(huì)帶來栓塞和組織壞死等未知風(fēng)險(xiǎn)，因此基因修飾MSCs 為科學(xué)家們提供了新思路[6]。

二、HGF

1984年Nakamura 等[14]首次從部分肝切除術(shù)后的大鼠血清中分離到HGF，研究發(fā)現(xiàn)HGF 是一種具有促進(jìn)增殖效應(yīng)的細(xì)胞因子?？茖W(xué)家們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，（1）HGF 系由α鏈（69 kDa）和β 鏈（34 kDa）通過一對(duì)二硫鍵鏈接構(gòu)成的異二聚體。α 鏈中有類似于纖溶酶原和凝血酶中的kringle 結(jié)構(gòu)，β 鏈中有類似絲氨酸蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域。HGF 的β 鏈蛋白序列還與擴(kuò)散因子同源；（2）HGF 主要由肝臟間質(zhì)細(xì)胞分泌，如肝星狀細(xì)胞、Kupff er 細(xì) 胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等；（3）HGF 可與特異性跨膜受體c-Met 結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，繼而發(fā)揮HGF 的生物學(xué)效應(yīng)。

HGF 是目前已知的促肝細(xì)胞有絲分裂最強(qiáng)的細(xì)胞因子，Mars 等[15]向無血清培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞加入1 ng/mL 的外源性HGF，即可觀察到其顯著促進(jìn)DNA 合成。除此之外，HGF還具有強(qiáng)有力的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和毛細(xì)血管管腔形成能力；抑制細(xì)胞凋亡的能力，減輕組織損傷；促遷移效應(yīng)，能夠提高多種細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力；高濃度條件下的腫瘤抑制效應(yīng)，抑制某些癌和肉瘤細(xì)胞系的生長[16-19]。

盡管HGF 具有如上眾多的正面效應(yīng)，但是HGF 的臨床應(yīng)用仍然有很多限制：（1）HGF 生理分泌量少，難以分離、富集和純化；（2）HGF 是大分子的糖基化蛋白，在血液中半衰期短，需要反復(fù)注射才能達(dá)到有效血藥濃度；（3）運(yùn)輸和保存困難；（4）致癌、促癌轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)耐藥等負(fù)面效應(yīng)[20-21]；（5）肝外器官的血液大量分流，直接影響了外源性HGF 對(duì)肝損傷的治療效果[17]。

三、HGF-MSCs 治療肝損傷

HGF 是MSCs 分泌的發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要細(xì)胞因子之一[22]。王榮等[23]研究發(fā)現(xiàn)，體外多次傳代培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSCs）均可分泌細(xì)胞因子HGF，但分泌的HGF 量很少且隨著MSCs 傳代次數(shù)的增加而降低。加上MSCs 在損傷部位存活能力低下，嚴(yán)重影響MSCs 治療效率。近年來，隨著基因修飾技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)HGF 基因修飾MSCs 獲得的HGF- MSCs 的研究越來越多，學(xué)者們也逐漸發(fā)現(xiàn)HGF-MSCs對(duì)于肝損傷修復(fù)可能有更好的治療效果（圖1）[24-52]。

（一）抑制凋亡

圖1 HGF-MSC 治療肝損傷

Zhang 等[24]在研究過表達(dá)HGF 的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs）對(duì)放射線誘發(fā)的肝損傷大鼠的治療作用中發(fā)現(xiàn)，HGF-ADSCs 治療組染色質(zhì)濃縮明顯逆轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞凋亡明顯減少，肝細(xì)胞再生相較于ADSCs 治療組更顯著。Jang 等[25]在研究HGF-MSCs 減輕對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中發(fā)現(xiàn)，HGF-MSCs 上清液處理的肝細(xì)胞活力增加，抗凋亡蛋白（Mcl-1）表達(dá)增加，促凋亡蛋白（Bad，Bik 和Bid）表達(dá)降低。Yu 等[26]將HGF-MSCs經(jīng)門靜脈注射至小體積肝移植術(shù)后（移植百分比為30%）的大鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠死亡率下降，肝再生增強(qiáng)；同時(shí)HGF及其受體c-Met 的表達(dá)量增加，且與肝再生呈正相關(guān)關(guān)系。同樣另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HGF/c-Met 信號(hào)途徑中斷時(shí)，再生肝臟的體積較小并且表現(xiàn)出廣泛的肝細(xì)胞死亡[27]。另外，過量表達(dá)的HGF 還可以抑制MSCs 的凋亡。Choi 等[28]在研究過表達(dá)HGF 對(duì)過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的MSCs 保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，HGF-MSCs 內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白減少，凋亡細(xì)胞的數(shù)量下降，細(xì)胞活力提高了1.68倍。以上研究提示HGF-MSCs 通過增強(qiáng)HGF/c-Met 途徑，發(fā)揮更顯著的抑制肝細(xì)胞凋亡和保護(hù)MSCs 作用，提高M(jìn)SCs 治療效率，最終促進(jìn)肝再生。

（二）誘導(dǎo)MSCs 向肝樣細(xì)胞分化

HGF 是誘導(dǎo)MSCs 向功能性肝細(xì)胞分化重要且有效因子之一[22]。無論是HGF-MSCs 還是在MSCs 中加入外源性的HGF[29]，MSCs 均可分化為功能性肝細(xì)胞。HGF 與其他細(xì)胞因子（胰島素樣生長因子1、白細(xì)胞介素1β 等）聯(lián)合誘導(dǎo)可提高M(jìn)SCs 分化的效率和質(zhì)量[30-31]。由于HGF 是誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵因子，因此HGF-MSCs 可能更有利于誘導(dǎo)MSCs 分化為肝樣細(xì)胞，從而提高M(jìn)SCs 的替代治療效果。

（三）降低氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是指在某些病理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡失衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷的過程[32]。Moon 等[33]將HGF-MSCs 移植到二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠中發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞的毒性降低，肝細(xì)胞內(nèi)活性氧種類減少，促凋亡蛋白和肝細(xì)胞凋亡減少。Choi 等[28]在H2O2誘導(dǎo)的HGF-MSCs 中發(fā)現(xiàn)，HGF 的過量表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平減少了27%，細(xì)胞活力明顯增加，提示HGFMSCs 可增強(qiáng)MSCs 抗氧化能力。因此HGF- MSCs 在治療肝損傷的過程中，可通過降低氧化應(yīng)激抑制凋亡，而損傷局部MSCs 的存活數(shù)量的增加，將發(fā)揮更大的移植效果。

（四）免疫調(diào)節(jié)

MSCs 通過分泌HGF 減輕免疫反應(yīng)，或使受體處于免疫耐受狀態(tài)來調(diào)控炎癥反應(yīng)，從而減輕肝臟損傷[34]。MSCs 來源HGF 可抑制單核細(xì)胞發(fā)育成熟為樹突狀細(xì)胞[35]，可有效抑制CD4+及CD8+T細(xì)胞增生[36]。Bian 等[37]研究顯示，過表達(dá)HGF 的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在體外混合淋巴反應(yīng)中仍維持BMSCs原本的增殖和分化能力，但明顯抑制了異常淋巴細(xì)胞增殖，并且對(duì)體外的細(xì)胞免疫具有更強(qiáng)的抑制效果。他們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HGF-BMSCs 和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMSCs 免疫抑制功能相似，但HGF-BMSCs 針對(duì)部分免疫細(xì)胞（如NIH3T3 和CD11b+/-細(xì)胞等）具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。朱金海等[38]研究發(fā)現(xiàn)，HGF-BMSCs 注射與單獨(dú)BMSCs 注射相比，更加顯著減輕急性移植物抗宿主病中的急性排斥反應(yīng)，并且大幅度延長受者的生存時(shí)間。由此可見，HGF 基因修飾明顯增強(qiáng)了MSCs 的免疫抑制功能，更有效地減輕免疫排斥反應(yīng)。

（五）抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生

各種病理性刺激因素、炎癥、氧化應(yīng)激等在造成肝細(xì)胞損傷的同時(shí)，往往也造成血管結(jié)構(gòu)破壞。肝內(nèi)缺血不僅加劇肝損傷，而且不利于肝臟損傷修復(fù)，因此減輕血管損傷或者促進(jìn)血管重建在肝損傷修復(fù)中具有重要意義。劉滋康 等[39]通過結(jié)扎大鼠股動(dòng)脈來模 擬局部肢體缺血，并且以它為模型研究HGF-BMSCs 在體內(nèi)促血管新生效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，HGF-BMSCs組血流灌注水平明顯高于MSCs組，而且HGF- BMSCs 與MSCs 相比，內(nèi)皮細(xì)胞促增殖、促遷移及重建血管結(jié)構(gòu)等效應(yīng)更顯著。Su 等[40]也有相似的發(fā)現(xiàn)，即HGFMSCs組毛細(xì)血管密度最高，提示這可能與HGF-MSCs 誘導(dǎo)更強(qiáng)的血管新生效應(yīng)密切相關(guān)。陳安平等[41]研究HGFBMSCs 改善慢性缺血心肌時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)血管生成顯著增加，從而改善了心肌缺氧微環(huán)境。因此在肝臟損傷時(shí)，MSCs旁分泌的HGF 可能也存在以上機(jī)制抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝臟新生血管的形成，從而改善肝臟缺血，而HGFBMSCs 可能增強(qiáng)了這種效應(yīng)。

（六）抗纖維化

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的中間環(huán)節(jié)，逆轉(zhuǎn)肝纖維化是防止肝衰竭的關(guān)鍵階段。目前普遍認(rèn)為，肝纖維化進(jìn)展的首要因素和中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活。在肝細(xì)胞損傷、炎癥等始動(dòng)因素作用下，HSCs 被激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞并產(chǎn)生大量細(xì) 胞外基質(zhì)[42]，基質(zhì)重塑，最終導(dǎo)致肝纖維化。因此促進(jìn)HSCs 的凋亡、減少基質(zhì)重塑可能是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要途徑[43]。以往的研究表明，在肝硬化大鼠模型中應(yīng)用外源性HGF 或單獨(dú)移植MSCs 均可減輕肝臟纖維化[44]，其原因可能與抑制HSCs 的激活和減少膠原在肝臟沉積有關(guān)[45]，HGF-MSCs 增強(qiáng)了這些效應(yīng)[46]。

1.誘導(dǎo)及促進(jìn)HSCs 的凋亡：目前認(rèn)為HSCs 的凋亡水平同肝纖維化的逆轉(zhuǎn)程度基本一致[42]。Kim 等[47]研究報(bào)道慢性肝損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，HGF 可能通過JNK 磷酸化促進(jìn)活化的HSCs 凋亡。蘇思標(biāo)等[48]發(fā)現(xiàn)MSCs 抑制HSCs 增殖的機(jī)制可能與RhoA-P27通路使HSCs細(xì)胞周期停滯有關(guān)。隨后學(xué)者們發(fā)現(xiàn)MSCs 發(fā)揮HSCs 的促凋亡作用可能與HGF有關(guān)[49]，作用于神經(jīng)生長因子P75 信號(hào)通路、Fas/FasL通路等逆轉(zhuǎn)肝纖維化[50]。HGF-MSCs 也可能從以上途徑促進(jìn)HSCs 的凋亡，甚至發(fā)揮更好的效果。

2.減少基質(zhì)重塑：當(dāng)肝組織受損時(shí)，HSCs 被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，同時(shí)基質(zhì)和膠原合成增加，降解減少，合成和降解平衡被打破，導(dǎo)致基質(zhì)重塑和肝臟纖維化[43]。Yu等[51]在研究減輕小體積肝移植大鼠模型中缺血再灌注和慢性損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，HGF-MSCs 明顯抑制小體積肝移植大鼠肝纖維化的形成，從而促進(jìn)肝再生，降低大鼠死亡率；在這一過程中，HGF-MSCs 的抗纖維化作用不僅與調(diào)節(jié)HSCs 活化和凋亡有關(guān)，還與顯著減輕膠原的沉積有關(guān)。Pulavendran 等[52]也發(fā)現(xiàn)HGF-BMSCs 可使Ⅰ型膠原明顯減少，細(xì)胞外基質(zhì)纖維溶解，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)肝纖維化。Zhang 等[24]在研究改善輻射誘導(dǎo)的肝纖維化過程中發(fā)現(xiàn)，HGF-ADSCs 可能通過下調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和纖維連接蛋白等，減少基質(zhì)重塑。

綜上所述，HGF-MSCs 不僅不會(huì)影響MSCs 原有的干細(xì)胞生物學(xué)特性，而且與單純的MSCs 或HGF 移植相比對(duì)肝損傷有明顯優(yōu)勢(shì)。HGF-MSCs 中過量表達(dá)的HGF 對(duì)MSCs抗氧化和抗凋亡的保護(hù)作用，解決了移植區(qū)MSCs 高凋亡率問題。HGF-MSCs 作為HGF 基因的細(xì)胞載體在損傷部位增加HGF 的分泌[53]，解除了HGF 的臨床應(yīng)用部分限制。因此HGF-MSCs 移植在肝損傷修復(fù)中充分發(fā)揮了MSCs 和HGF優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)它們?cè)谂R床應(yīng)用上的部分劣勢(shì)，發(fā)揮 “1+1＞2”的治療效果[54]。

四、問題和展望

上述眾多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均展示MSCs 在促進(jìn)肝細(xì)胞再生和修復(fù)方面具有廣闊的前景，同時(shí)也證實(shí)了MSCs 的安全性，未發(fā)現(xiàn)致瘤性。但HGF-MSCs 能夠高表達(dá)HGF，HGF 的配體c-Met 在腫瘤中也是高表達(dá)，因此HGF- MSCs 是否在致瘤方面有更大的風(fēng)險(xiǎn)，HGF-MSCs 能否精準(zhǔn)高效地調(diào)控HGF 分泌等還有待進(jìn)一步研究。相信隨著干細(xì)胞研究技術(shù)的進(jìn)一步成熟，一定能夠給肝病患者帶來新的曙光。