桃YABBY 轉(zhuǎn)錄因子家族的生物信息學(xué)分析

韓繼紅,劉金鳳,劉慧敏*

1.濮陽(yáng)市市容環(huán)境衛(wèi)生管理處,河南 濮陽(yáng)457000

2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開(kāi)發(fā)中心,國(guó)家林業(yè)和草原局泡桐研究開(kāi)發(fā)中心,經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州450003

YABBY 是種子植物特有的一個(gè)小基因家族[1]，該基因家族編碼的轉(zhuǎn)錄因子包括兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：N 末端一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和C 末端一個(gè)YABBY 結(jié)構(gòu)（螺旋-環(huán)-螺旋）[2,3]。目前在所有被子植物中鑒別到的YABBY家族可分為5 個(gè)亞家族，分別為CRABS CLAW(CRC)、FILAMENTOUS FLOWER(FIL)/YABBY3(YAB3)，INNER NO OUTER(INO)，YABBY2(YAB2)和YABBY5(YAB5)[4,5]，每個(gè)亞家族都包括一個(gè)早期分化的ANA 被子植物序列，表明現(xiàn)存開(kāi)花植物最后的共同祖先中至少有5 個(gè)YABBY基因。YABBY基因在植物中參與多種生物過(guò)程，在葉片和葉片衍生器官的發(fā)育中起關(guān)鍵作用，例如子葉、花器官、外胚珠外皮發(fā)育、維持細(xì)胞極性、葉邊緣建成和葉片生長(zhǎng)[6-9]。擬南芥中，YABBY在營(yíng)養(yǎng)器官中主要是在側(cè)向器官的背面表達(dá)，并且在葉片和抑制莖尖分生組織過(guò)程中有重復(fù)的功能[7,10-12]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，不管是核心雙子葉植物還是單子葉植物，YABBY在營(yíng)養(yǎng)器官中有相似的功能[13-15]。

桃是一種重要的落葉果樹(shù)，通常認(rèn)為是5000 多年前在中國(guó)長(zhǎng)江或珠江中下游馴化而來(lái)的，現(xiàn)已在世界各地得到廣泛種植[16]。由于桃果實(shí)色澤艷麗、風(fēng)味佳美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受各國(guó)消費(fèi)者的喜愛(ài)。由于桃樹(shù)二倍體（2n=16），且基因組較?。s220 M），使得桃成為研究果樹(shù)比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的模式物種。桃基因組測(cè)序的完成為從基因組層面全面鑒定及研究該物種中的基因家族提供了基礎(chǔ)[17]。本研究基于桃基因組最新組裝及注釋版本，系統(tǒng)鑒定了桃中YABBY基因家族成員，并做了初步分析，為深入研究該基因家族在桃中的功能提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

桃基因組數(shù)據(jù)（v2.1）來(lái)源于Phytozome 植物基因組比較數(shù)據(jù)庫(kù)（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），桃、擬南芥、水稻和無(wú)油樟YABBY 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列來(lái)源于PlantTFDB 植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）。

1.2 桃YABBY 基因的鑒定及分析

在Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）下載YABBY家族的隱馬爾科夫模型（PF04690），并使用HMMER 在桃蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，參數(shù)設(shè)置cut--ga。將檢索到的基因與2.1 中下載的YABBY基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)一致，提交到在線軟件SMART（smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)鑒別到的基因均含有YABBY 保守結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明鑒定數(shù)據(jù)可靠，可進(jìn)行下一步分析。

桃YABBY基因推導(dǎo)蛋白序列特征分析使用在線軟件（https://web.expasy.org/compute_pi/），基因結(jié)構(gòu)特征及在染色體上的分布使用TBtools 軟件可視化[18]。

進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建的主要步驟為：（1）使用MAFFT 對(duì)蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析（默認(rèn)參數(shù)）；（2）將序列比較結(jié)果導(dǎo)入FastTree 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（默認(rèn)參數(shù)）；（3）使用MEGA 7 對(duì)構(gòu)建好的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化。

桃YABBY基因蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域的多重比較使用MAFFT（默認(rèn)參數(shù)），比較結(jié)果使用在線軟件ESPript 3（http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php）進(jìn)行可視化。

桃YABBY基因啟動(dòng)子（上游2000 bp）順式作用元件的預(yù)測(cè)使用在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），使用TBtools 進(jìn)行可視化[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃YABBY 家族成員的鑒定及蛋白特征

通過(guò)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索和使用YABBY 的隱馬爾科夫模型（PF04690）在桃基因組中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩種方法鑒別到的桃YABBY基因一致，均為6 個(gè)基因，表明本次數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。

對(duì)鑒別到的6 個(gè)桃YABBY基因的推導(dǎo)蛋白序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)桃中YABBY基因可轉(zhuǎn)錄成15 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，編碼15 個(gè)蛋白序列。對(duì)這15 個(gè)推導(dǎo)蛋白序列進(jìn)行在線分析，發(fā)現(xiàn)其序列長(zhǎng)度從136 到232個(gè)氨基酸不等，分子量變化范圍為：15.6～25.9 kDa，等電點(diǎn)范圍：5.29～9.30，且均含有YABBY 保守結(jié)構(gòu)域（表1）。

表1 桃YABBY 家族基因基本信息統(tǒng)計(jì)Table 1 Basic information statistics of YABBY gene family in Prunus persica

2.2 桃YABBY 家族基因結(jié)構(gòu)分析

圖1 桃YABBY 家族基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene strusture of YABBY in Prunus persica

真核生物的基因通常為不連續(xù)基因，即編碼區(qū)的序列（外顯子）是不連續(xù)的，會(huì)被非編碼序列（內(nèi)含子）隔開(kāi)。基因起始和終止密碼子兩側(cè)的序列即側(cè)翼序列，為非編碼序列，通常包括能夠調(diào)控基因表達(dá)的元件。通過(guò)對(duì)桃YABBY基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)YABBY基因的內(nèi)含子數(shù)量較多（4-6個(gè)），結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜（圖1）。由于可變剪切，同一個(gè)基因存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的情況較多，僅Prupe.1G250500和Prupe.5G075800 只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本；Prupe.1G290100 有3 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，均含有6 個(gè)內(nèi)含子；Prupe.2G140400 有4 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中轉(zhuǎn)錄本1 和2 含有6 個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄本3 和4 含有5 個(gè)內(nèi)含子；Prupe.6G147600 有4 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中轉(zhuǎn)錄本1 和2 含有5 個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄本3 和4 含有4 個(gè)內(nèi)含子；Prupe.7G245200 有2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別含有6 個(gè)和5 個(gè)內(nèi)含子（圖1）。

2.3 桃YABBY 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化特征

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)主要基于序列的相似性進(jìn)行構(gòu)建，可反應(yīng)基因之間的相似程度，進(jìn)而推測(cè)基因的功能。本研究基于桃、擬南芥、水稻和無(wú)油樟基因組中YABBY的蛋白序列，采用最大似然法構(gòu)建了YABBY家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)YABBY基因家族可明顯分為5 類，且每一類別中均有桃YABBY基因，說(shuō)明桃基因組中含有植物YABBY基因家族的全部類別（圖2）。

圖2 桃、擬南芥、水稻和無(wú)油樟YABBY 家族進(jìn)化樹(shù)Fig.2 YABBY family evolutionary tree of Prunus persica,Arabidopsis,rice and Amborella trichopoda

將桃YABBY基因家族的保守序列進(jìn)行多序列比較，發(fā)現(xiàn)桃中6 個(gè)YABBY 家族成員均含有C2C2鋅指結(jié)構(gòu)和YABBY（螺旋-環(huán)-螺旋）保守結(jié)構(gòu)（圖3），Prupe.6G147600 的第4 條轉(zhuǎn)錄本和Prupe.7G242500的第2條轉(zhuǎn)錄本的鋅指結(jié)構(gòu)不完整，Prupe.2G140400的第3和第4條轉(zhuǎn)錄本的YABBY結(jié)構(gòu)不完整。鋅指結(jié)構(gòu)中的sheet3 較sheet1 和sheet2 更為保守，coil3 和coil4 的差異大于coil1 和coil2；YABBY 結(jié)構(gòu)域中的coil1 和coil2 的保守性高于coil3，helix1、helix2 和sheet 部分序列保守性均較高。

圖3 桃YABBY 基因家族保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved domains of YABBY gene family in Prunus persica

2.4 桃YABBY 基因在染色體上的分布特征

基于桃基因組的組裝和注釋結(jié)構(gòu)，將桃YABBY基因在染色體上的分布進(jìn)行可視化。發(fā)現(xiàn)桃YABBY基因分布在5 條染色體上（圖4），分別為1、2、5、6、7 號(hào)染色體，其中Prupe.1G250500（INO 類）和Prupe.1G290100（CRC 類）均分布在1 號(hào)染色體上，F(xiàn)IL/YAB3 類Prupe.2G140400 和Prupe.5G075800分別分布在2 號(hào)和5 號(hào)染色體上；Prupe.6G147600（YAB2 類）和Prupe.7G245200（YAB5 類）分別分布在6 號(hào)和7 號(hào)染色體上。

圖4 桃YABBY 家族基因在染色體上的分布Fig.4 YABBY gene distribution on the chrosomes of Prunus persica

2.5 桃YABBY 基因啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件預(yù)測(cè)

啟動(dòng)子一般是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的非編碼區(qū)列，除含有轉(zhuǎn)錄起始的核心元件，通常還含有多種誘導(dǎo)元件，例如激素響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)元件、光應(yīng)答元件等。本研究對(duì)YABBY基因家族成員轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp 的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)YABBY基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有大量誘導(dǎo)元件，包括光應(yīng)答、茉莉酸甲酯響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)等元件。其中，Prupe.1G250500 特異性含有干旱誘導(dǎo)元件，Prupe.7G245200.1 特異含有種子調(diào)控元件（圖5）。

圖5 桃YABBY 基因啟動(dòng)子中鑒別到的順式作用元件Fig.5 Cis-element identified in gene promoters of YABBYs in Prunus persica

3 討論

YABBY 是種子植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，被子植物的中的YABBY家族成員在葉片以及葉片的衍生器官發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4,7,10,19]。本研究基于桃最新基因組組裝及注釋結(jié)果，在桃中鑒定到6個(gè)YABBY基因，總共15 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，可翻譯成15 個(gè)的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度范圍為136～232 個(gè)氨基酸，序列較短，與前人研究發(fā)現(xiàn)YABBY 蛋白較小的結(jié)果一致[19]。

內(nèi)含子是真核生物特有的序列，一般在會(huì)轉(zhuǎn)錄在前體mRNA中，然后經(jīng)過(guò)剪切產(chǎn)生成熟的mRNA，不同的剪切方式能產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本，從而翻譯為不同的蛋白質(zhì)，在基因的可變剪切中發(fā)揮重要作用[20]。對(duì)YABBY基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該家族基因的內(nèi)含子較多（4～6 個(gè)），結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，與桃中該基因家族有較多的轉(zhuǎn)錄本（15 個(gè)）的結(jié)果一致。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)不僅能揭示物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，也能反映基因序列的相似程度，從而推測(cè)基因的功能。通過(guò)構(gòu)建桃、擬南芥、水稻和無(wú)油樟YABBY基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)桃中含有植物YABBY家族的所有類別。Prupe.1G290100 屬于CRC 類，該類基因在被子植物的心皮和核心雙子葉植物的蜜腺發(fā)育中起調(diào)節(jié)作用[21-24]。Prupe.6147600 屬于YAB2 類，擬南芥中該類基因參與外側(cè)器官遠(yuǎn)軸端細(xì)胞分化的方向[7]。Prupe.7G245200 屬于YAB5 類，植物中該類基因主要在子葉、葉片和花器官中表達(dá)[13,25]。Prupe.1G250500 屬于INO 類，該基因在胚珠外膜的形成和不對(duì)稱生長(zhǎng)中必不可少[26]。Prupe.2G140400 和Prupe.5G075800 屬于FIL/YAB3，擬南芥中該類基因參與花和果實(shí)的發(fā)育[7]。

YABBY基因編碼的蛋白通常在N 末端有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，在C 末端有一個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，即YABBY 結(jié)構(gòu)域[18]。多序列比對(duì)結(jié)果顯示6 個(gè)基因編碼的YABBY 蛋白均含有上述兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中4 條轉(zhuǎn)錄本的鋅指結(jié)構(gòu)或YABBY 結(jié)構(gòu)不完整，這些轉(zhuǎn)錄本編碼大蛋白是否能行使YABBY 轉(zhuǎn)錄因子的功能，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件對(duì)于基因的表達(dá)有重要影響，本研究發(fā)現(xiàn)桃YABBY基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含光應(yīng)答、茉莉酸甲酯響應(yīng)和脫落酸響應(yīng)等多種順式元件，表明該基因的表達(dá)可能會(huì)受到環(huán)境、激素等的影響。Prupe.7G245200.1（YAB5 類）特異含有種子調(diào)控元件，可能與該類基因參與子葉的發(fā)育有關(guān)[7]。