鯊魚硫酸軟骨素及膠原蛋白復(fù)方改善小鼠骨關(guān)節(jié)炎作用研究

顏晨燕，王梨萍，屈 鑫，李 鋒，3，石賢愛，3

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福州 350106；2.福州大學(xué)藥物生物技術(shù)與工程研究所，福州 350106；3.福建省醫(yī)療器械與生物醫(yī)藥省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350106）

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖胺聚糖，其結(jié)構(gòu)基本單元為D-葡萄糖醛酸與N-乙酰-D-氨基半乳糖通過1，3-糖苷鍵連接形成的二糖，二糖單元之間通過β-1，4-糖苷鍵連接而成。CS在動物體內(nèi)廣泛存在，多位于動物軟骨中，是結(jié)締組織的重要組成部分。近年來研究表明，CS具有多方面的生物活性。CS可降低血脂含量，抑制血栓的生成，具有調(diào)血脂和預(yù)防動脈粥樣硬化的作用［1］；在抗關(guān)節(jié)炎方面，CS也具有顯著的作用，CS可抑制機(jī)體關(guān)節(jié)損傷因子如基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、IL-1β的產(chǎn)生，從而延緩軟骨損傷的進(jìn)展，起著緩解關(guān)節(jié)炎的作用［2］；CS還能促進(jìn)成骨細(xì)胞生長，誘導(dǎo)新骨生長，加速骨損傷的愈合過程［3］。此外，CS還具有抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤以及抗黏連等作用，因而在臨床上被廣泛應(yīng)用［4］。膠原蛋白為細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白，在動物體內(nèi)廣泛存在，主要存在于動物的皮膚和骨組織中。膠原蛋白最顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是三螺旋結(jié)構(gòu)，由3條α多肽鏈纏繞形成超螺旋結(jié)構(gòu)。膠原蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有低免疫原性和良好的生物相容性，因而用途廣泛［5］。近年來研究表明，膠原蛋白還具有調(diào)血脂、抗腫瘤、抗關(guān)節(jié)炎、免疫調(diào)節(jié)等方面的生物活性［6］，因而也被大量應(yīng)用在膳食補(bǔ)充及醫(yī)療方面。

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性關(guān)節(jié)退行性疾病，其臨床特征主要為關(guān)節(jié)軟骨損傷、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成和滑膜炎癥等［7］。OA的發(fā)生發(fā)展與衰老、運(yùn)動損傷等因素密切相關(guān)［8-9］。軟骨損傷是OA最主要的病因，關(guān)節(jié)的整體穩(wěn)態(tài)同時依賴于相關(guān)組織的相互作用，包括骨和滑膜組織。在OA的發(fā)生發(fā)展中，軟骨下骨將出現(xiàn)病變硬化，且隨著病情的發(fā)展其病變程度將越來越明顯［10］。到目前為止，在臨床上尚無有效的無創(chuàng)性治療方法能逆轉(zhuǎn)退行性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展［11］。

鯊魚（Carcharhiniformes）屬于脊椎動物門，軟骨綱，板鰓亞綱，在世界各大洋都有廣泛分布，是我國重要的海洋魚類資源［12］。鯊魚頭骨及椎骨均為軟骨，含有豐富的硫酸黏蛋白、骨膠原蛋白成分［13］，鯊魚鰭骨中也含有豐富的粘多糖和膠原蛋白［14］。作為魚翅及相關(guān)產(chǎn)品的加工下腳料，鯊魚軟骨并未得到充分的利用，大多被直接丟棄，造成極大資源浪費(fèi)，并帶來了環(huán)境污染問題。盡管有部分研究者研究了硫酸軟骨素對骨關(guān)節(jié)炎的改善作用［15-16］，但通過口服補(bǔ)充膠原蛋白，是否對骨關(guān)節(jié)炎有改善作用尚未可知，膠原蛋白和硫酸軟骨素復(fù)方用于改善骨關(guān)節(jié)炎方面的研究尚未見報(bào)道。基于此，在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，本研究將源自鯊魚軟骨的高純度硫酸軟骨素及膠原蛋白進(jìn)行復(fù)方配伍，以考察其對注射膠原蛋白酶所致的小鼠膝關(guān)節(jié)炎的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

鯊魚硫酸軟骨素，由本實(shí)驗(yàn)從鯊魚軟骨中分離制備，純度≥95%；鯊魚膠原蛋白，由本實(shí)驗(yàn)從鯊魚軟骨中制備，純度≥90%；以上兩者按照質(zhì)量比2∶1混合制得鯊魚硫酸軟骨素和膠原蛋白復(fù)方（shark chondroitin sulfate and collagen complex，SCC）；Ⅱ型膠原蛋白酶（酶活性為125 U·mg-1），購自美國Sigma公司；IL-1β、IL-4酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，RayBiotech公司；番紅-O染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；天狼猩紅染色試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；Masson染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；H&E染色試劑，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

健康10周齡雄性昆明小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司（SCXK滬2012-0002），在標(biāo)準(zhǔn)條件下分組飼養(yǎng)，共分4組，每組8只小鼠，具體分組為陰性對照組、OA模型組、SCC高劑量組、SCC低劑量組。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠自由飲食及攝食。本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》相關(guān)規(guī)定。

1.1.3 主要儀器

RM2245組織切片機(jī)，德國徠卡公司；KD-P組織攤片機(jī)，浙江科迪公司；SH-1000熒光全自動酶標(biāo)儀，日本Corona公司。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型

為了誘導(dǎo)OA，參考已報(bào)道的造模方法［16］，稍作改動，簡述如下。取1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，剃去右膝膝關(guān)節(jié)部位毛并消毒后，通過髕下韌帶在右膝關(guān)節(jié)間隙注射5U （體積4 μL）Ⅱ型膠原蛋白酶（溶于無菌生理鹽水中，酶活性為125 U·mg-1）。陰性組注射4μL無菌生理鹽水作為對照。注射時將針的注射深度限制在1.5 mm，以免損傷關(guān)節(jié)軟骨。

在實(shí)驗(yàn)的第0、2、4、6天各注射一次Ⅱ型膠原蛋白酶，每日觀察關(guān)節(jié)腫脹情況，持續(xù)觀察4周，記錄并拍照。

1.2.2 給藥

各組別均每日灌胃。SCC高劑量組按照300 mg·kg-1每日固定灌胃給藥，SCC低劑量組為150 mg·kg-1；陰性對照與OA模型組每日取等體積生理鹽水灌胃。藥物干預(yù)4周后處死動物取血清，解剖后取小鼠關(guān)節(jié)，剔除肌肉后，用游標(biāo)卡尺測量左右關(guān)節(jié)橫向直徑并計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度（%），計(jì)算公式為：腫脹度（%）=（右膝關(guān)節(jié)直徑-左膝關(guān)節(jié)直徑）/左膝關(guān)節(jié)直徑 ×100。之后，將膝關(guān)節(jié)脫鈣處理，進(jìn)行病理切片染色分析。

1.2.3 關(guān)節(jié)病理切片及染色分析

取關(guān)節(jié)在室溫下用5%硝酸脫鈣10 h，后浸泡于4%多聚甲醛中24～48 h，梯度乙醇脫水（50%、70%、80%、90%和100%乙醇各1 h）、透明后常規(guī)組織包埋，組織切片做H&E染色以觀察軟骨形態(tài)。切片脫蠟水化后分別采用番紅-O染色試劑盒、Masson染色試劑盒以及天狼猩紅染色試劑盒按照說明書操作進(jìn)行染色。番紅-O染色結(jié)果軟骨呈紅色，骨呈藍(lán)色或綠色；Masson染色結(jié)果膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色，胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色；天狼猩紅染色結(jié)果膠原纖維呈紅色，肌肉、神經(jīng)膠質(zhì)、胞漿、紅細(xì)胞呈黃色。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附

小鼠眼球取血后斜放于冰上3 h，3 500 r·min-1離心20 min，分離血清。取IL-1β和IL-4酶聯(lián)免疫吸附試劑盒按照說明書操作，檢測在血清中的表達(dá)水平，每個組別檢測3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組別的平均表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差統(tǒng)計(jì)法（T檢驗(yàn)，P＜0.05）進(jìn)行分析比較，用Origin 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

如圖1和圖2所示，造模4周后觀察小鼠關(guān)節(jié)腫脹情況，可見模型組小鼠注射Ⅱ型膠原蛋白后右側(cè)關(guān)節(jié)較左側(cè)關(guān)節(jié)明顯腫脹（圖1-B）。實(shí)驗(yàn)第3周，可觀察到給藥組動物的關(guān)節(jié)腫脹程度逐漸減輕。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCC低劑量（150 mg·kg-1）干預(yù)具有一定程度的抑制膝關(guān)節(jié)腫脹作用（圖1-C）。相比低劑量，SCC高劑量（300 mg·kg-1）干預(yù)抑制關(guān)節(jié)腫脹作用更為明顯（圖1-D）；各組小鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度情況比較如圖2所示，藥物干預(yù)組動物的膝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯低于模型對照組。

2.2 H＆E染色分析

如圖3所示，模型組軟骨細(xì)胞具有一定程度增殖，部分部位出現(xiàn)纖維肉芽組織填充（黑色箭頭），軟骨細(xì)胞分布不均勻，成混亂排列（圖3-B）；與模型組相比，SCC低劑量（150 mg·kg-1）干預(yù)可改善軟骨細(xì)胞分布，纖維肉芽組織消失（圖3-C）。SCC高劑量（300 mg·kg-1）干預(yù)后關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，軟骨四層結(jié)構(gòu)比較清晰，排列規(guī)律，軟骨細(xì)胞呈類圓形，細(xì)胞核紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)粉紅色，細(xì)胞排列整齊，分布及染色均勻（圖3-D）。

2.3 Masson染色分析

由于軟骨和骨的細(xì)胞外基質(zhì)中普遍分布著膠原纖維，因此Masson染色基質(zhì)部分呈大面積藍(lán)色，膠原纖維分為多種類型，軟骨中主要為Ⅱ型膠原，骨組織中則主要為Ⅰ型膠原。圖4顯示了膠原（黑色箭頭）在關(guān)節(jié)中的分布情況，與陰性對照組相比，模型組的軟骨層中膠原纖維含量顯著降低（圖4-B），表明膝關(guān)節(jié)軟骨受到明顯損傷。與模型組相比，SCC低劑量干預(yù)（150 mg·kg-1）可使軟骨層的膠原含量明顯增加（圖4-C），SCC高劑量（300 mg·kg-1）干預(yù)也可顯著增加膠原含量，但相比低劑量增加并不明顯。以上結(jié)果表明，SCC給藥后可明顯改善OA中膠原纖維流失狀況。

2.4 天狼猩紅染色分析

天狼猩紅染色是利用兩種陰離子染料混合成的試劑進(jìn)行染色的一種方式，對膠原的顯示也較為明顯，在該染色法中膠原組織顯紅色。如圖5染色結(jié)果所示，與陰性對照組相比，模型組的膠原組織（黑色箭頭）含量明顯減少（圖5-B），表明軟骨組織出現(xiàn)明顯損傷。與模型組相比，SCC低劑量（150 mg·kg-1）干預(yù)可明顯增加膠原含量（圖5-C），SCC高劑量（300 mg·kg-1）干預(yù)可更大程度提升膠原含量（圖5-D）。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了針對OA給予SCC干預(yù)可有效補(bǔ)充關(guān)節(jié)中膠原蛋白含量，從而減輕癥狀。

2.5 番紅-O染色分析

軟骨組織由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)組成，軟骨組織及其周圍的軟骨膜構(gòu)成軟骨。軟骨根據(jù)基質(zhì)內(nèi)所含纖維素成分不同分為透明軟骨、彈性軟骨、纖維軟骨。番紅O著色與陰離子的濃度近似成正比關(guān)系，間接反映基質(zhì)中蛋白多糖的含量和分布。當(dāng)軟骨受到損傷時，軟骨中的糖蛋白會釋放出來，使基質(zhì)成分分布不均勻，從而導(dǎo)致番紅O淡染或不著色。由圖6可知，與陰性對照組相比，模型組軟骨組織著色明顯較淺，且著色分布不均勻，表明軟骨中糖蛋白（黑色箭頭）流失明顯，軟骨組織受到明顯損傷（圖6-B）。與模型組相比，SCC低劑量（150 mg·kg-1）處理可顯著增加著色程度，但著色分布還不太均勻（圖6-C），表明SCC低劑量處理對軟骨損傷有一定程度的修復(fù)作用。相比低劑量處理，SCC高劑量（300 mg·kg-1）處理既能增加軟骨組織的著色程度，也能提升著色的均勻度（圖6-D），表明在該劑量下，SCC處理具有較好地修復(fù)OA軟骨組織的作用。

2.6 血清IL-1β和IL-4表達(dá)水平分析

通過ELISA法分析各組動物血清中IL-1β和IL-4的表達(dá)量，結(jié)果如圖7所示。模型組造模后小鼠血清IL-1β的表達(dá)水平顯著高于陰性對照組（P＜0.05，圖7-A），而與此相反的是，模型組動物血清IL-4的表達(dá)水平顯著低于陰性對照組（P＜0.05，圖7-B）。與模型組相比，低劑量給藥組（150 mg·kg-1）的兩種細(xì)胞因子的血清表達(dá)水平均有一定的改善，但不具有顯著性。高劑量組（300 mg·kg-1）動物的血清IL-1β水平顯著低于模型組（P＜0.05，圖7-A），血清IL-4的水平顯著高于模型組（P＜0.05，圖7-B）。以上結(jié)果表明，SCC給藥干預(yù)可顯著改善OA的炎癥狀態(tài)。

3 討論

在本研究中，筆者采取向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Ⅱ型膠原酶的方法來造模，用以加速降解關(guān)節(jié)軟骨組織中的膠原蛋白，從而造成關(guān)節(jié)軟骨和滑膜病理損傷，以構(gòu)建OA模型，相應(yīng)損傷程度與酶的用量相關(guān)。采用Ⅱ型膠原蛋白酶直接注射入關(guān)節(jié)腔進(jìn)行造模所需時間較短，酶的用量易控制，OA的病理損傷程度也易于控制，較其他造模方法而言更加簡便［16］。本實(shí)驗(yàn)采用了Masson染色法和天狼猩紅染色法來分析關(guān)節(jié)軟骨組織中膠原的分布情況（圖3，圖4），結(jié)果顯示，OA小鼠關(guān)節(jié)的膠原分布明顯低于陰性對照組小鼠，表明出現(xiàn)了明顯的關(guān)節(jié)軟骨損傷，而采用SCC干預(yù)可有效改善OA小鼠的關(guān)節(jié)膠原缺失狀態(tài)，從而緩解OA的癥狀。

作為關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的重要組成部分，糖蛋白通過周圍連接蛋白被束縛于軟骨基質(zhì)中。在正常生理狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨中糖蛋白的產(chǎn)生與降解達(dá)成一種動態(tài)的平衡，這對維持關(guān)節(jié)組織的新陳代謝和完整性是至關(guān)重要的。而在OA關(guān)節(jié)中，該平衡遭到破壞，糖蛋白的降解速度高于其合成速度，使得軟骨組織產(chǎn)生明顯的缺損。目前，軟骨基質(zhì)糖蛋白流失已被看作是OA發(fā)生的病理標(biāo)志［17］。在本研究中，筆者采用番紅-O染色的方法來分析關(guān)節(jié)軟骨組織的糖蛋白分布狀況（圖6），結(jié)果顯示，OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨的糖蛋白含量顯著減少，病理缺損明顯，而采用SCC干預(yù)可顯著提高糖蛋白含量，有效緩解關(guān)節(jié)軟骨組織的病理損傷。

在OA的發(fā)生發(fā)展中，血清中滑膜細(xì)胞可產(chǎn)生IL-1β致炎因子，通過IL-1β與腫瘤壞死因子等相互作用，最終將活化NF-κB信號通路，激活炎癥表達(dá)通路［18］。同時，IL-1β將刺激軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解；刺激軟骨細(xì)胞和滑膜產(chǎn)生一氧化氮，抑制軟骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡［19-21］。而對正常軟骨細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-4通過抑制IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)金屬蛋白酶而起到軟骨保護(hù)作用；同時IL-4也參與軟骨細(xì)胞應(yīng)力信號傳導(dǎo)，是該通路中活躍的信號因子，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的完整性［22-25］。本研究顯示，SCC給藥干預(yù)可顯著降低OA小鼠的血清IL-1β水平和提升血清IL-4水平（圖7），表明SCC干預(yù)可有效降低OA小鼠的炎癥狀態(tài)，也提示SCC對OA的改善作用可能是通過作用于IL-1β或IL-4信號通路而實(shí)現(xiàn)。

4 小結(jié)

本文研究了鯊魚源硫酸軟骨素及膠原蛋白復(fù)方（SCC）對小鼠OA的改善作用。采用向膝關(guān)節(jié)內(nèi)腔定量注射Ⅱ型膠原蛋白酶的方式構(gòu)建OA動物模型，每天口服灌胃給予SCC干預(yù)4周。研究表明，SCC可恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨中流失的膠原蛋白，降低IL-1β和上調(diào)IL-4的表達(dá)水平，從而顯著改善Ⅱ型膠原蛋白酶所致的小鼠膝關(guān)節(jié)炎癥狀。研究顯示，這種源自鯊魚軟骨的復(fù)方具有開發(fā)成膳食補(bǔ)充劑的良好前景，為鯊魚軟骨資源的深入開發(fā)提供了基礎(chǔ)。