中華鱉Wnt4基因克隆及表達(dá)分析

張英萍，凌 晨，王利華，沙 航，鄒桂偉，胥 燾，羅相忠，梁宏偉

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；3.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；4.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌 443002）

Wingless 基 因 最 初 由 SHARMA 和CHOPRA［1］在果蠅（Drosophila melanogaster）中發(fā)現(xiàn)，其基因突變能導(dǎo)致果蠅翅膀的缺失，隨后一種原癌基因int1［2］從小鼠（Mus musculus）乳腺瘤病毒誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌中被克隆，由于2個(gè)基因具有較高的同源性且功能相似，故將它們合稱為Wingless-type MMTV integration site family（Wnt）基因。Wnt基因家族是一類重要的分泌性糖蛋白信號(hào)分子，可以激活多種信號(hào)通路，在動(dòng)物的早期發(fā)育及各種生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用［3～4］。從線蟲到哺乳動(dòng)物均發(fā)現(xiàn)Wnt基因家族的存在［5］，其具有高度的保守性［6］。

Wnt4基因是Wnt基因家族重要的成員之一，與脊椎動(dòng)物兩性生殖系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)［7］，介導(dǎo)Mullerian導(dǎo)管的初始形成，并調(diào)節(jié)類固醇生成的中腎細(xì)胞向發(fā)育中的性腺遷移［8～9］。在哺乳動(dòng)物中，Wnt4基因已經(jīng)被證實(shí)是卵巢分化的關(guān)鍵因子［10］。在小鼠中，Wnt4基因通過(guò)調(diào)節(jié)Follistatin基因的表達(dá)來(lái)參與卵巢發(fā)育［11］，雌性小鼠Wnt4的表達(dá)缺失導(dǎo)致XX性腺的雄性化［8］，而雄性中Wnt4的過(guò)表達(dá)則破壞睪丸血管和睪丸甾酮的合成［9］。在人體中，Wnt4與Dax1協(xié)同調(diào)控女性卵巢發(fā)育并阻止睪丸的形成［12］。Wnt4在哺乳動(dòng)物調(diào)控性腺發(fā)育、調(diào)節(jié)繆勒氏管的形成、調(diào)控卵巢類固醇的生成及抑制睪丸的形成中起關(guān)鍵作用［13］。此外，Wnt4在哺乳動(dòng)物中還參與了腎臟、腎上腺、乳腺和生殖系統(tǒng)的形成［7］。在魚類中，Wnt4與性腺發(fā)育密切相關(guān)。 在半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）中，Wnt4參與了性腺發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，且在精巢表達(dá)水平高于卵巢［14］。在黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）中，Wnt4被證實(shí)與卵巢發(fā)育和性別分化有關(guān)［15］。

中華鱉（Pelodiscus sinensis）屬爬行綱，龜鱉目，鱉科，鱉屬，俗稱甲魚、水魚、團(tuán)魚［16］。在中國(guó)除西藏、青海和新疆外，各省市（自治區(qū)）均有分布，是我國(guó)重要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象之一，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值［17］。在養(yǎng)殖過(guò)程中，雄性個(gè)體具有明顯的個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、裙邊寬厚、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富以及市場(chǎng)單價(jià)高等優(yōu)勢(shì)，因此性別控制和全雄苗種培育一直以來(lái)都是中華鱉研究的重要方向。本研究通過(guò)克隆中華鱉Wnt4基因，分析其在雌雄個(gè)體不同組織中的表達(dá)特征、胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征以及Wnt激動(dòng)劑對(duì)Wnt4基因表達(dá)的影響，進(jìn)而探討Wnt4基因在中華鱉性別分化過(guò)程中的作用，以期為進(jìn)一步開展中華鱉性別決定和性腺分化研究提供理論基礎(chǔ)，并為全雄苗種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用中華鱉成鱉于2018年3月采自安徽省喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。中華鱉雌雄個(gè)體各3只，其中雄性平均體質(zhì)量為（395.36±20.55）g，雌性平均體質(zhì)量為（283.72±18.02）g，經(jīng)麻醉后解剖收集腦、性腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腸和肌肉等組織樣品，置于 -80℃冰箱保存，用于總RNA的提取。中華鱉鱉卵于2018年5—6月收集自安徽省喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)卵場(chǎng)，置于溫度為（30.0±0.5）℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱（濕度在80% ～85%）中進(jìn)行孵化。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Wnt激動(dòng)劑（Wnt agonist 1是具有細(xì)胞透性的Wnt信號(hào)通路激活劑，誘導(dǎo)依賴于β-catenin和TCF-4的轉(zhuǎn)錄活性，Selleck公司），總RNA提取試劑Trizol Reagent（Invitrogen公司），PCR Mix和GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit（北京擎科生物有限公司），SMARTer?RACE cDNA 5′/3′Kit（Takara），DNA凝膠純化試劑（南京諾維贊生物有限公司），PMD-18T載體（Takara）和DH5α感受態(tài)細(xì)胞（武漢清陽(yáng)渡生物有限公司），無(wú)特殊說(shuō)明的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 總RNA提取和cDNA第一條鏈合成

按照Trizol法提取總RNA，用超微量分光光度計(jì) NP80 （德 國(guó)，IMPLEN）測(cè) 定 RNA 的OD260nm/OD280nm檢測(cè)RNA的質(zhì)量、純度以及濃度，并用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit（北京擎科生物有限公司）和SMARTer?RACE cDNA 5′/3′Kit（大連，Takara）按照操作指南分別合成cDNA和RACE cDNA第一條鏈。

1.4 中華鱉Wnt4基因克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得海龜（Chelonia mydas）、三趾箱龜（Terrapene carolina triunguis）和美洲短吻鱷（Alligator mississippiensis）等物種Wnt4基因的cDNA序列，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物Wnt4-CF和Wnt4-CR（表1），以中華鱉卵巢組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 L，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2 min；98℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，35個(gè) 循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃10 min。利用DNA凝膠純化試劑盒（大連，Takara）回收目的片段產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物連接到PMD-18T載體（大連，Takara）上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取經(jīng)菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序。

基于獲得的中華鱉Wnt4基因片段的cDNA序列設(shè)計(jì)3′RACE引物Wnt4-3′-GSP和Wnt4-3′-NGSP，5′RACE 引物Wnt4-5′-GSP（表1）。以RACE cDNA第一條鏈為模板，GSP（Wnt4-3′-GSP和Wnt4-5′-GSP）和UPM（RACE試劑盒引物）為引物進(jìn)行降落式PCR，反應(yīng)程序如下：94℃5 min；94℃30 s，72℃3 min，5個(gè) 循環(huán)；94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，5 cycle；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25個(gè)循環(huán)。再以3′端降落式PCR產(chǎn)物50倍稀釋液為模板，Wnt4-3′-NGSP和UPM short（RACE試劑盒引物）為引物進(jìn)行半巢式PCR反應(yīng)，程序?yàn)椋?4℃5 min；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接和轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序。

1.5 序列分析以及同源性分析

用DNAMAN軟件包對(duì)獲得的5′cDNA和3′cDNA及中間序列進(jìn)行全長(zhǎng)拼接，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用在線ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找開放閱讀框（ORF）；利用ExPASy ProtParam工具預(yù)測(cè)Wnt4蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；利用SOPMA工具預(yù)測(cè)Wnt4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；氨基酸的多重比對(duì)采用Clustal X和DNAMAN 完成；糖基化位點(diǎn)采用在線軟件NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測(cè)，用Mega7.0中的鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用1 000次自舉檢驗(yàn)分析（bootstrap analysis）評(píng)估進(jìn)化樹分支節(jié)點(diǎn)的置信度。

1.6 組織表達(dá)特征分析

基于獲得的中華鱉Wnt4基因cDNA全長(zhǎng)序列用Primer 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物Wnt4-F和Wnt4-R（表1）。中華鱉18sRNA用作內(nèi)參基因［18］，按照以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，40個(gè) 循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。數(shù)據(jù)采用相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法，即基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct法，2-△△Ct值代表目的基因與對(duì)照組表達(dá)量之間的倍數(shù)差異［19］。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SD）表示，用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），使用Turkey多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

1.7 胚胎不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)特征

按照TOKITA和KURATANI［20］胚胎分期標(biāo)準(zhǔn)采集30℃孵化條件下中華鱉胚胎發(fā)育的第14～21期胚胎樣品，置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移到 -80℃冰箱中保存。采用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的性別標(biāo)記進(jìn)行胚胎性別鑒定［21］后進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析。

1.8 Wnt激動(dòng)劑對(duì)Wnt4基因表達(dá)量的影響

依據(jù)已有研究報(bào)道得知：孵化溫度為30℃時(shí)，孵化至第9天生殖嵴隆起，孵化至第15天原始性腺形成，孵化至第26天完成性腺分化［22］。因此我們?cè)诜趸恋?5天原始性腺形成時(shí)，使用Wnt激動(dòng)劑對(duì)胚胎動(dòng)物極注射處理，用微量進(jìn)樣器分別注射1.0 g·L-1、2.5 g·L-1和5.0 g·L-1的Wnt激動(dòng)劑各1 L，對(duì)照組dd H2O 1 L，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。收集注射后0、6、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h胚胎樣品，用于定量表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華鱉Wnt4基因全長(zhǎng)cDNA序列特征和系統(tǒng)進(jìn)化

中華鱉Wnt4 cDNA序列全長(zhǎng)為2 432 bp，開放閱讀框（ORF）為1 095 bp，編碼364個(gè)氨基酸，5′-UTR 48 bp和3′-UTR 1 289 bp（圖1）。Wnt4蛋白含有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)分別位于N-109和N-310處，具有Wnt基因家族特有保守片段“CKCHGVSGSC”、24個(gè)Wnt蛋白家族重要的半胱氨酸保守序列。用在線工具ExPASy對(duì)中華鱉Wnt4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則蜷曲（c）占46.98%、α-螺旋（h）占38.74%、延伸鏈（e）占9.89%、β轉(zhuǎn)角（t）占4.4%。

不同物種Wnt4氨基酸序列分析結(jié)果見表2，中華鱉與海龜、三趾箱龜、美洲短吻鱷、達(dá)馬拉鼴鼠（Fukomys damarensis）、裸鼢鼠（Heterocephalus glaber）、人（Homo sapiens）、小鼠、斑馬魚（Danio rerio）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、半滑舌鰨、櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）和厚殼貽貝（Mytilus coruscus）同源性如表2所示，與海龜和三趾箱龜?shù)耐葱宰罡摺?/p>

表1 中華鱉Wnt4基因擴(kuò)增引物信息Tab.1 Information of primers for Wnt4 amplification in Pelodiscus sinensis

中華鱉Wnt4蛋白與海龜、三趾箱龜、美洲短吻鱷、裸鼢鼠、人、小鼠、斑馬魚、牙鲆、半滑舌鰨、櫛孔扇貝和厚殼貽貝等11個(gè)物種的蛋白序列多重比較分析見圖2，其序列比較保守，與其他物種有100多個(gè)Wnt保守位點(diǎn)。

基于鄰接法（NJ）構(gòu)建Wnt4蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果為三大支，哺乳動(dòng)物和爬行動(dòng)物聚為一大支，其中哺乳類和爬行動(dòng)物分別聚為一支：中華鱉與海龜、三趾箱龜和美洲短吻鱷等爬行動(dòng)物聚為一支。硬骨魚類聚為一大支，貝類聚為一大支。

表2 不同物種與中華鱉Wnt4蛋白氨基酸序列同源性比對(duì)Tab.2 Comparative identity of amino acid sequence of Wnt4

2.2 Wnt4基因在中華鱉組織中的表達(dá)特征

Wnt4基因在中華鱉雌雄個(gè)體不同組織中的表達(dá)結(jié)果表明，Wnt4基因普遍存在于中華鱉的腦、性腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腸以及肌肉等組織中，且廣泛表達(dá)，但是表達(dá)存在一定的組織和性別特異性（圖4）。性腺中表達(dá)量最高，肺次之；并且雌性卵巢表達(dá)顯著高于雄性精巢（P＜0.05），具有顯著的性別二態(tài)性。腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸和肌肉中，Wnt4表達(dá)量顯著低于性腺和肺（P＜0.05）。肝臟中雄性的表達(dá)顯著高于雌性（P＜0.05），而在腦、肺、腎臟和肌肉中，雌性表達(dá)顯著高于雄性（P＜0.05）。

2.3 Wnt4基因在中華鱉胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征

為研究Wnt4基因在中華鱉性腺分化中的作用，采用qRT-PCR方法分析中華鱉Wnt4基因在雌雄中華鱉胚胎不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示，Wnt4基因在性腺分化前的第14期已經(jīng)有表達(dá)，性腺開始分化后在雌性胚胎中表達(dá)持續(xù)高于雄性（P＜0.05），在第20期和21期雌性胚胎中的表達(dá)極顯著高于雄性胚胎（P＜0.01），表達(dá)呈現(xiàn)性別二態(tài)性。

2.4 Wnt激動(dòng)劑對(duì)中華鱉Wnt4基因表達(dá)的影響

為研究Wnt激動(dòng)劑對(duì)中華鱉性別發(fā)育的影響，采用qR T-PCR方法分析了注射Wnt激動(dòng)劑后中華鱉胚胎發(fā)育過(guò)程中Wnt4基因的表達(dá)水平。不同濃度Wnt激動(dòng)劑處理后Wnt4基因的相對(duì)表達(dá)如圖6所示。

在雌性胚胎中，注射1.0 g· L-1和2.5 g·L-1的Wnt激動(dòng)劑后，6～12 h表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖6-A，C），72 h表達(dá)達(dá)到最大峰值，96 h表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。注射5 g·L-1的Wnt激動(dòng)劑后，在6～24 h內(nèi)Wnt4表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖6-E），在36 h表達(dá)顯著增加（P＜0.05），72 h表達(dá)達(dá)到最大峰值，96 h后表達(dá)逐漸降低，Wnt4表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

在雄性胚胎中，注射1.0 g·L-1Wnt激動(dòng)劑后，6 h后顯著上調(diào)Wnt4的表達(dá)（P＜0.05）（圖6-B），36 h表達(dá)達(dá)到最大峰值，48 h后表達(dá)逐漸降低，72 h后表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。注射2.5 g·L-1Wnt激動(dòng)劑后，6 h顯著上調(diào)Wnt4的表達(dá)（P＜0.05）（圖6-D），96 h表達(dá)達(dá)到最大峰值，120 h時(shí)表達(dá)開始顯著降低（P＜0.05）。注射5 g·L-1Wnt激動(dòng)劑后，6～96 h表達(dá)逐漸上升，Wnt4表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖6-F），96 h表達(dá)達(dá)到最大峰值，120 h時(shí)表達(dá)開始顯著降低（P＜0.05），但顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

在雌性胚胎中，注射1.0 g·L-1Wnt激動(dòng)劑，Wnt4基因在36～144 h表達(dá)上調(diào)；濃度2.5 g·L-1時(shí)，在24～168 h表達(dá)上調(diào)；濃度5.0 g·L-1時(shí)，在24～168 h表達(dá)上調(diào)。在雄性胚胎中注射1.0 g·L-1Wnt激動(dòng)劑，Wnt4基因在6～36 h表達(dá)上調(diào)；濃度2.5 g·L-1時(shí)，在6～96 h表達(dá)上調(diào)；濃度5.0 g·L-1時(shí)，在6～168 h表達(dá)上調(diào)。在胚胎中，隨著注射濃度的增加，Wnt激動(dòng)劑的作用時(shí)間總體上更持久。

3 討論

Wnt信號(hào)通路是在進(jìn)化上高度保守的信號(hào)途徑，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖以及凋亡等生理過(guò)程中均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的一大熱點(diǎn)［23］。本研究得到的Wnt4基因cDNA序列全長(zhǎng)為2 432 bp，編碼364個(gè)氨基酸，具有24個(gè)Wnt蛋白家族重要的半胱氨酸保守序列，2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)且有100多個(gè)保守位點(diǎn)，符合Wnt結(jié)構(gòu)特點(diǎn)［2］。中華鱉Wnt4與同為龜鱉目的海龜和三趾箱龜同源性最高，達(dá)91.74%，與其他物種的同源性也較高。

Wnt4基因在哺乳動(dòng)物［24-25］、魚類［26-27］、貝類［28-30］、蝦蟹類［31］等生物中的不同組織中均存在表達(dá)，Wnt4基因表達(dá)具有廣泛性且其功能具有多樣性，其可能參與了多種組織細(xì)胞的生命過(guò)程。中華鱉Wnt4基因在腦、性腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腸和肌肉等組織均有表達(dá)。Wnt4基因在中華鱉中同樣具有多種功能，推測(cè)其可能參與了多種組織細(xì)胞的生命過(guò)程。Wnt4基因與多種動(dòng)物的性別決定和性別分化密切相關(guān)，Wnt4基因突變，會(huì)導(dǎo)致性腺發(fā)育異常甚至性反轉(zhuǎn)［7-9，11］。Wnt4基因缺失的小鼠可導(dǎo)致雌性胚胎發(fā)生雄性化［8］。BARRIONUEVO 等［32］研 究 發(fā) 現(xiàn)，小 鼠Wnt4基因在性別決定之前的性腺中存在表達(dá)，性別分化后在卵巢中仍持續(xù)表達(dá)，精巢中的表達(dá)顯著下調(diào)，Wnt4基因參與雌性性別分化過(guò)程。本研究中華鱉Wnt4基因在性別分化前的第14期就在雌性胚胎中高表達(dá)，且在之后的胚胎發(fā)育過(guò)程中一直維持雌性高表達(dá)，雌性胚胎中的表達(dá)顯著高于雄性胚胎中的表達(dá)，Wnt4基因同樣也參與了中華鱉雌性性腺分化的過(guò)程。Wnt4基因發(fā)生突變會(huì)引起性腺發(fā)育異常甚至性反轉(zhuǎn)［7，9，11］。Wnt信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物性別決定的關(guān)鍵因子［7］，但其作用機(jī)制仍不清楚。本研究中Wnt激動(dòng)劑能上調(diào)中華鱉Wnt4基因的表達(dá)，隨著濃度的增加Wnt4基因上調(diào)表達(dá)水平變高，推測(cè)其對(duì)性別發(fā)育有一定的作用，而其作用機(jī)制和對(duì)性別發(fā)育的作用還有待進(jìn)一步研究。

本研究獲得中華鱉Wnt4基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并分析序列特征、表達(dá)特征以及Wnt激動(dòng)劑對(duì)其表達(dá)的影響。中華鱉Wnt4基因表達(dá)具有廣泛性和一定的組織特異性，可能參與多種組織生物學(xué)過(guò)程，尤其是在卵巢發(fā)育或其功能維持上起關(guān)鍵作用，參與了中華鱉雌性性腺分化過(guò)程，結(jié)果有助于中華鱉性別分化分子機(jī)制的進(jìn)一步研究。