呋喃唑酮代謝物在中華絨螯蟹體內(nèi)消除規(guī)律

黃宣運(yùn)，沈曉盛，史永富，蔡友瓊

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 200090）

呋喃唑酮（furazolidone）又名痢特靈，是一種人工合成的硝基呋喃類廣譜抗生素，通過(guò)干擾細(xì)菌氧化還原酶起到殺菌作用［1］，可用于水產(chǎn)動(dòng)物胃腸道疾病的預(yù)防與治療［2］。從1993年開始，歐盟最先禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中使用呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因等硝基呋喃類藥物，主要原因是它們的代謝物具有潛在的致突變和致癌風(fēng)險(xiǎn)［3］。研究表明，呋喃唑酮在動(dòng)物體內(nèi)可迅速代謝為3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ），且可較長(zhǎng)時(shí)間殘留在動(dòng)物體內(nèi)［4］。歐盟規(guī)定硝基呋喃類代謝物在水產(chǎn)品中的最低要求執(zhí)行限為1.0 μg·kg-1［5］。我國(guó)規(guī)定水產(chǎn)品動(dòng)物中不得檢出硝基呋喃類代謝物［6］，目前的判定依據(jù)與歐盟一致。

雖然硝基呋喃類藥物屬于禁用藥物，但違規(guī)使用現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生［7］，鑒于監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的需要，已在羅非魚［8-9］、海參［10］、雜交鱧（Channa maculata × C.argus）［11］、牙 鲆（Paralichthys olivaceus）［12］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［13］、斑 點(diǎn) 叉 尾 鮰（Ietalurus punetaus）［14］以 及 對(duì)蝦［15-16］等水產(chǎn)動(dòng)物中開展了硝基呋喃類代謝物的藥代動(dòng)力學(xué)研究。對(duì)于中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis，以下簡(jiǎn)稱河蟹），僅開展了呋喃西林代謝物的消除規(guī)律研究［17-18］，而對(duì)呋喃唑酮代謝物消除規(guī)律的研究尚未見(jiàn)諸報(bào)道。本研究以河蟹扣蟹為給藥對(duì)象，研究了模擬實(shí)際養(yǎng)殖條件下的呋喃唑酮代謝物消除規(guī)律，評(píng)估了河蟹苗種期間使用呋喃唑酮藥物的殘留風(fēng)險(xiǎn)，以期為上市河蟹食品安全保障提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

AOZ和AOZ-D4，含量≥99%，購(gòu)于德國(guó)Dr公司。呋喃唑酮原藥（含量≥98%）購(gòu)于衢州偉榮藥業(yè)有限公司。乙酸乙酯、甲醇、正己烷等為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

Thermo TSQ Quantum Ultra高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；PHS-25酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠）；Mili-Q 純水儀（法國(guó)Millipore）；Biofuge Primo R離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；FA1004電子天平（上海精天電子儀器廠）；BSA2202SCW 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；SHA-CA恒溫水浴搖床（金壇市迅生儀器廠）；N-EVAP-111氮吹儀（美國(guó)Organomation）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及場(chǎng)地

實(shí)驗(yàn)用蟹規(guī)格為（13±2）g的健康扣蟹（約7 500只，雌雄性別比約為1∶1）購(gòu)自上海市崇明興陸?zhàn)B殖合作社。實(shí)驗(yàn)開始前，隨機(jī)抽取18只河蟹分為3組，取其肌肉、肝胰腺、鰓組織進(jìn)行AOZ測(cè)定，結(jié)果均為未檢出AOZ。藥餌制備：將呋喃唑酮原粉與粘合劑（玉米淀粉）混勻后，加入溫水調(diào)和，再按照每3 000 mg· kg-1和9 000 mg·kg-1比例加入飼料混勻，攝食率按1%計(jì)算。

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在面積為300 hm2、水深為1.2 m的室外養(yǎng)殖池塘進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前對(duì)水體和底泥中呋喃唑酮及AOZ殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢出。養(yǎng)殖期間水溫保持在20.0～27.5℃。

鍋爐汽包水位自動(dòng)調(diào)節(jié)的任務(wù)是使給水量與鍋爐的蒸發(fā)量相平衡，并維持汽包中的水位在工藝允許的范圍內(nèi)。水位過(guò)高，會(huì)影響汽包內(nèi)汽水分離效果，使汽包出口的飽和蒸汽帶水增多，造成不良后果；水位過(guò)低則造成水的急速蒸發(fā)，汽水自然循環(huán)破壞，鍋爐壁容易被燒壞，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成爆炸事故。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥方法

將實(shí)驗(yàn)扣蟹暫養(yǎng)7 d后，將7 500只扣蟹隨機(jī)平均放入P1組、P2組和對(duì)照組P0。將P1組、P2組和P0組分別飼養(yǎng)于4 m ×2 m ×1 m的自制鐵網(wǎng)籠中，放入池塘。其中P1組和P2組每次投喂劑量分別為30 mg·kg-1和90 mg·kg-1的藥餌，對(duì)照組投喂河蟹飼料，3組的投喂量保持一致。每天投喂2次（早上8∶00和下午3∶00各1次），連續(xù)投喂5 d。最后1次投喂后1 h，將河蟹表面清洗干凈，轉(zhuǎn)入池塘。按照河蟹常規(guī)養(yǎng)殖方法進(jìn)行養(yǎng)殖［19］。

1.2.2 取樣方法

實(shí)驗(yàn)樣品分別按照最后1次給藥后的1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、96 h、192 h、288 h、384 h、480 h、720 h、960 h、1 200 h、1 440 h、1 920 h、2 400 h、2 880 h和3 600 h進(jìn)行取樣。根據(jù)河蟹的生長(zhǎng)狀況，實(shí)驗(yàn)的前1 440 h，每6只河蟹為1個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)1 440 h后，每3只河蟹為1個(gè)樣品，每個(gè)樣品分別取其肌肉、肝胰腺和鰓3個(gè)組織，樣品置于-18℃冰箱中待測(cè)。

1.2.3 AOZ前處理方法

準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品置于30 mL離心管中，依次加入50μL內(nèi)標(biāo)工作液（100.0 ng· mL-1）、5 mL 鹽 酸 溶 液（0.5 moL·L-1）和150μL 2-硝基苯甲醛溶液（0.05 moL·L-1），渦旋1 min后，置于恒溫水浴搖床37℃避光振蕩16 h。取出離心管冷卻至室溫，加入5 mL磷酸氫二鉀溶液（0.76 moL·L-1），調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，離心5 min，取有機(jī)相至離心管中，40℃氮?dú)獯蹈?。加?.0 mL 5%甲醇水溶液溶解殘留物，過(guò)0.22μm水相膜，供上機(jī)分析。

色譜柱為CAPCELL PAK C18（100mm×2.0 mm i.d.，5μm），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。流動(dòng)相為0.1%甲酸（含2 mmol·L-1乙酸銨）（A）和甲醇（B）。流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1。

1.2.5 AOZ質(zhì)譜條件

測(cè)定時(shí)設(shè)置為ESI+離子模式，離子傳輸管和氣化室溫度均為300℃，鞘氣（N2）和輔助氣（N2）壓力分別為35 psi和8 psi，碰撞氣（Ar2）壓力為1.5 mTorr，采用選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式；碎片離子及碰撞能量見(jiàn)表2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Program of mobile phase gradient elution

表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)的定性離子、定量離子與碰撞能量Tab.2 Qualitative ions，quantitative ions and collision energy condition for selected reaction monitoring

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制與測(cè)定

配置1、2、5、20、40、100 ng·mL-1AOZ系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3的分析條件進(jìn)行處理。以AOZ與內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積比為縱坐標(biāo)，AOZ濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

參考徐維海等［9］的方法，計(jì)算呋喃唑酮代謝物平均消除速率（v），單位為μg·（kg·h）-1，計(jì)算公式如下：

式中：Cmax為消除過(guò)程中測(cè)得AOZ的最高濃度（μg·kg-1），Cmin為消除過(guò)程中測(cè)得的最低濃度（μg·kg-1），t1為測(cè)到Cmax所對(duì)應(yīng)時(shí)間（h），t2為測(cè)到Cmin所對(duì)應(yīng)時(shí)間（h）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法檢出限和定量限

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，AOZ在1.0～100 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=0.024 092 1+0.092 585 6X，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 3。經(jīng)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)確定方法檢出限0.25 μg·kg-1（S/N≥3），定量限為0.5μg·kg-1（S/N≥10），回收率在80% ～110%之間，滿足檢測(cè)AOZ的定性和定量分析。

2.2 河蟹肌肉中AOZ的消除規(guī)律

從扣蟹到成蟹養(yǎng)殖過(guò)程中河蟹肌肉中AOZ含量的消除規(guī)律如圖2所示。 肌肉中AOZ含量呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，前期（1～288 h）下降速度較快，后期下降速度明顯降低。兩組不同濃度處理河蟹的AOZ在肌肉中的變化趨勢(shì)基本一致。最高峰值均出現(xiàn)在最后1次給藥后的1 h，其值分別為（172.0±7.2）、（952.0±75.2）μg·kg-1；第2個(gè)高峰均出現(xiàn)在48 h，其值分別為（77.0±7.9）、（217.0±14.9）μg·kg-1。第3個(gè)高峰僅在P2組出現(xiàn)（192 h），含量為（217.0±14.9）μg·kg-1。P1組河蟹肌肉中的AOZ在720 h時(shí)已經(jīng)降低到（1.2±0.2）μg·kg-1。P1組河蟹肌肉中的AOZ含量低于判定限（1.0μg·kg-1）的時(shí)間為停止給藥后的960 h。根據(jù)公式計(jì)算得到P1組河蟹肌肉中AOZ的平均消除速率為0.238 μg·（kg·h）-1。P2組河蟹肌肉中的AOZ含量在1 200 h時(shí)下降為（1.3±0.2）μg·kg-1，肌肉中AOZ含量低于判定限所需時(shí)間為停止給藥后的1 440 h。根據(jù)公式計(jì)算得到P2組河蟹肌肉中AOZ的平均消除速率為0.767μg·（kg·h）-1。P2組的最高濃度是P1組的5.5倍，代謝時(shí)間比P1組長(zhǎng)480 h，平均消除速率為P1組的3.2倍。

2.3 河蟹肝胰腺中AOZ的消除規(guī)律

整個(gè)消除階段，河蟹肝胰腺中AOZ含量消除規(guī)律如圖3所示。將圖3與圖2對(duì)比發(fā)現(xiàn)，河蟹肝胰腺與肌肉中AOZ的變化趨勢(shì)基本一致。兩試驗(yàn)組河蟹肝胰腺中AOZ的最高峰值均出現(xiàn)在最后1次給藥后的1 h，其值分別為（347.0±25.2）（P1）、（2 475.2±128.3）（P2）μg·kg-1。第二個(gè)高峰均出現(xiàn)在48 h，其值分別為（217.0±14.9）（P1）、（752.0±34.5）（P2）μg·kg-1。第三個(gè)高峰均出現(xiàn)192 h，其值分別為（156.0±16.4）（P1）、（491.0±25.8）（P2）μg·kg-1。P1組河蟹肝胰腺中的AOZ降低到判定限（1.0 μg·kg-1）附近，所需時(shí)間為960 h，P2組為1 440 h。P1組河蟹肝胰腺中的AOZ低于判定限所需時(shí)間為1 200 h，P2組為1 920 h。根據(jù)公式計(jì)算，P1組肌肉中AOZ的平均消除速率為0.361 μg·（kg·h）-1，P2組為1.72μg·（kg·h）-1。

2.4 河蟹鰓中AOZ的消除規(guī)律

整個(gè)消除階段，與肌肉和肝胰腺變化趨勢(shì)一致，鰓中AOZ呈現(xiàn)波動(dòng)下降趨勢(shì)（圖4）。鰓中AOZ在停藥后1 h達(dá)到最高值，其值分別為（196.0±17.7）（P1）、（786.0±40.9）（P2）μg·kg-1，低于同期肝胰腺組織中AOZ的含量。與肌肉和肝胰腺相比，鰓中AOZ的下降速率最慢。P1組鰓中的AOZ降低到判定限（1.0 μg·kg-1）附近，所需時(shí)間為960 h，P2組為1 440 h，其值分別為（1.2±0.1）、（2.2±0.1）μg·kg-1。P1組鰓中的AOZ低于判定限所需時(shí)間為1 440 h，P2組為1 920 h。根據(jù)公式計(jì)算，P1組肌肉中AOZ的平均消除速率為0.136 μg·（kg·h）-1，P2組為0.409μg·（kg·h）-1。

3 討論

3.1 河蟹不同組織中AOZ的消除規(guī)律

在停藥后的1 h，各組織中AOZ的含量均達(dá)到最高值，肝胰腺中AOZ的含量高于肌肉和鰓組織，其主要原因?yàn)楦我认偈求w內(nèi)藥物代謝的主要器官，藥物進(jìn)入機(jī)體后，部分藥物直接進(jìn)入肝胰腺，還有部分藥物可通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入肝胰腺，從而導(dǎo)致肝胰腺中AOZ含量高于其他組織［20］。各組織中AOZ也以肝胰腺消除速率最快，以P1組為例，肝胰腺中AOZ消除速率為肌肉的1.5倍，為鰓的2.7倍。此外，河蟹各組織消除過(guò)程中均出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，這在水產(chǎn)品中藥物代謝中較為常見(jiàn)［14-15，21］，其主要原因可能與腸-肝循環(huán)、胃腸循環(huán)的非齊性有關(guān)［21］，但對(duì)于產(chǎn)生的機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)中，P2組河蟹各組織AOZ的消除速率均高于P1組，其原因可能是AOZ在河蟹體內(nèi)的消除為一級(jí)動(dòng)力消除，藥物在體內(nèi)濃度越高，消除速率越快，當(dāng)藥物濃度降低后，消除速率逐漸下降。

3.2 不同物種中AOZ的消除規(guī)律

在本實(shí)驗(yàn)中，各組織中AOZ含量降低至判定限（1.0μg·kg-1）的最短時(shí)間為960 h，最長(zhǎng)時(shí)間為1 920 h。譚志軍等［13］研究報(bào)道，以15 mg·kg-1（體質(zhì)量）劑量，每天投喂2次，連續(xù)投喂5 d，在185 d時(shí)，大菱鲆肌肉中AOZ的含量為（29.68±4.11）μg·kg-1。劉永濤等［22］研究報(bào)道，以100 mg·kg-1（體質(zhì)量）劑量，每天投喂2次，連續(xù)投喂5 d，在停止給藥90 d后，斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉中AOZ降低至檢測(cè)不出水平。AOZ在體內(nèi)殘留時(shí)間較長(zhǎng)，主要原因可能與AOZ能夠與體內(nèi)蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵形式緊密結(jié)合有關(guān)［23］。AOZ在不同物種中殘留時(shí)間存在較大差異，這可能與給藥劑量、實(shí)驗(yàn)溫度、富集濃度、養(yǎng)殖環(huán)境等因素有關(guān)［18］，也可能是不同物種之間的差異造成的。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以河蟹扣蟹為研究對(duì)象，模擬實(shí)際用藥和養(yǎng)殖條件，系統(tǒng)研究了AOZ在河蟹體內(nèi)的消除規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，整個(gè)消除階段，AOZ在河蟹體內(nèi)消除呈現(xiàn)前快后慢的規(guī)律。AOZ在河蟹各組織中殘留時(shí)間長(zhǎng)，最長(zhǎng)可達(dá)1 920 h。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)遵守相關(guān)規(guī)定禁止使用呋喃唑酮，同時(shí)還要加強(qiáng)管理，避免（苗種、飼料、漁藥等）投入品帶入呋喃唑酮，造成不必要的損失。