響應(yīng)面法優(yōu)化蒸餾型牛奶酒發(fā)酵工藝

馬榮山，王清，邢艷芳

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

奶酒是以乳及乳制品為原料，經(jīng)酵母菌和乳酸菌發(fā)酵制成的飲料酒，按制作工藝可分為發(fā)酵型奶酒和蒸餾型奶酒[1]。發(fā)酵型奶酒風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，有良好的保健作用[2-4]，但常溫下無(wú)法久貯，因而逐漸演化產(chǎn)生了蒸餾型奶酒。蒸餾型奶酒是由乳清經(jīng)發(fā)酵后蒸餾制成的，是蒙古族獨(dú)具民族特色的乳飲料，其酒體清亮透明，有純正、清雅、和諧的乳香與酒香，微酸爽口，含有多種維生素和氨基酸，有特殊的保健功能和輔助治療作用[5-6]。蒸餾奶酒雜醇油和甲醇含量也特別低，是一種既營(yíng)養(yǎng)又衛(wèi)生的低度酒[7]。

目前，人們對(duì)酒的需求逐漸向營(yíng)養(yǎng)化、功能化轉(zhuǎn)變，奶酒會(huì)被越來(lái)越多的人重視。本研究以牛乳為主要原料，通過(guò)新的發(fā)酵工藝提高蒸餾奶酒的質(zhì)量并使其更符合大眾的口味，有較大的市場(chǎng)價(jià)值及發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

鮮牛乳、白砂糖：市售；

酵母菌：安琪牌葡萄酒高活性干酵母；乳酸球菌：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院釀造實(shí)驗(yàn)室保藏；

檸檬酸、酒石酸鉀、氫氧化鈉、硫酸銅、亞鐵氰化鉀等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

HH-6恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；HG330恒溫培養(yǎng)箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；酒精比重計(jì)：河北省滄縣杜生熱工儀表廠；糖度計(jì)：沈陽(yáng)市玻璃計(jì)四廠；全玻璃蒸餾器等。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 主要分析測(cè)定方法

酒精度測(cè)定：酒精計(jì)法；總酸測(cè)定：酸堿中和法；總酯測(cè)定：指示劑法[8]。

1.3.3 發(fā)酵技術(shù)要點(diǎn)

1.3.3.1 原料乳的驗(yàn)收

選擇不含抗生素及防腐劑的新鮮牛乳為原料，按GB5409-1985《牛乳檢驗(yàn)方法》執(zhí)行。

1.3.3.2 巴氏滅菌

調(diào)制后的乳清加熱到65℃，保溫30 min，以殺滅有害微生物，確保發(fā)酵順利進(jìn)行。

1.3.3.3 發(fā)酵劑的制備

酵母菌發(fā)酵劑：干酵母→10 mL 5%蔗糖溶液，28℃活化30 min→1 mL活化酵母菌→10 mL含8%蔗糖的乳清，培養(yǎng)48 h→1 mL酵母菌→100 mL含8%蔗糖的乳清，培養(yǎng)48 h→酵母菌發(fā)酵劑；

乳酸菌發(fā)酵劑：乳酸菌干粉→10 mL脫脂乳培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h→1 mL乳酸菌液→100 mL脫脂乳培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h→乳酸菌發(fā)酵劑。

1.3.3.4 發(fā)酵

經(jīng)調(diào)制滅菌的乳清液中依次接入定量的酵母菌和乳酸菌發(fā)酵劑，30℃下發(fā)酵培養(yǎng)7 d。發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾除去蛋白質(zhì)沉淀以及菌體等雜質(zhì)，煎酒停止發(fā)酵。

1.3.3.5 蒸餾

發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)入蒸餾階段。經(jīng)2次蒸餾的奶酒酒精體積分?jǐn)?shù)可以達(dá)到15%～25%。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

在酵母菌和乳酸菌接種比例為4∶1、30℃發(fā)酵7 d的條件下，選擇初始糖度、初始pH、接入乳酸菌時(shí)間、混合接種量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)成品酒的酒精體積分?jǐn)?shù)、總酸含量、總酯含量以及感官評(píng)分的綜合評(píng)定，考察各因素對(duì)發(fā)酵的影響，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criterion of sensory score for distilled milk wine

1.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蒸餾型奶酒發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Minitab 15軟件中響應(yīng)面設(shè)計(jì)程序的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以X1初始糖度、X2初始pH、X3接入乳酸菌時(shí)間、X4混合接種量為自變量（自變量編碼值1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平），Y酒精體積分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，對(duì)蒸餾型奶酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平表Table 2 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始糖度對(duì)發(fā)酵的影響

初始糖度對(duì)發(fā)酵的影響，見(jiàn)表3。

表3 初始糖度對(duì)成品酒質(zhì)量的影響Table 3 Effect of initial sugar content on the quality of distilled milk wine

釀酒酵母屬于乳糖非發(fā)酵型酵母，不能利用乳清中的乳糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，因此用蔗糖額外補(bǔ)充糖分。由表3可知，糖度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生不良影響，調(diào)整發(fā)酵液的初始糖度為19°Bx時(shí)，成品酒的酒精體積分?jǐn)?shù)最高，感官評(píng)價(jià)最好。

2.1.2 初始pH對(duì)發(fā)酵的影響

初始pH對(duì)發(fā)酵的影響，見(jiàn)表4。

表4 初始pH對(duì)成品酒質(zhì)量的影響Table 4 Effect of initial pH value on the quality of distilled milk wine

酵母菌適宜在中性或微酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)，pH的變化會(huì)影響其生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。酸度高有利于抑制雜菌，但使成酒略帶澀味；酸度過(guò)低則易受微生物侵染，且成品寡淡，欠爽口[9-10]。從表4可以看出，調(diào)整乳清的初始pH到4.5時(shí)，成品的酒精度較高，各項(xiàng)指標(biāo)較好，風(fēng)味口感最佳。

2.1.3 接入乳酸菌時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

接入乳酸菌時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響，見(jiàn)表5。奶酒的發(fā)酵是酒精和乳酸聯(lián)合發(fā)酵，酵母發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸作用生成乳酸乙酯，賦予奶酒獨(dú)特的風(fēng)味。接入酵母菌之后，乳酸菌的接入時(shí)間不同會(huì)導(dǎo)致成品酒酒體有機(jī)酸組成和風(fēng)味物質(zhì)不同[11]。由表5可知，酵母菌和乳酸菌一起接入（0 h），成品酒質(zhì)量較差，酒精體積分?jǐn)?shù)也不高。在酵母單獨(dú)發(fā)酵24 h后接入乳酸菌可使菌種之間達(dá)到良好的協(xié)同作用，奶酒的酒精體積分?jǐn)?shù)最高，感官評(píng)價(jià)最好。

表5 接入乳酸菌時(shí)間對(duì)成品酒質(zhì)量的影響Table 5 Effect of the time that inoculate lactobacillus on the quality of distilled milk wine

2.1.4 混合接種量對(duì)發(fā)酵的影響

混合接種量對(duì)發(fā)酵的影響，見(jiàn)表6。

表6 混合接種量對(duì)成品酒質(zhì)量的影響Table 6 Effect of inoculating amount of mix-fermentation on the quality of distilled milk wine

酵母菌和乳酸菌的混合接種量對(duì)成酒的品質(zhì)有很大的影響。若酵母菌的接種量太少，則發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，且產(chǎn)生的乙醇量較低；乳酸菌接種量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致成品酸度降低、口味寡淡，且影響產(chǎn)品中乳酸乙酯的形成；如果酵母菌接種量太多，菌種生長(zhǎng)過(guò)快、過(guò)密，會(huì)導(dǎo)致大量的酵母菌早衰和菌體自溶現(xiàn)象，產(chǎn)生苦味和酵母臭味，從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)；乳酸菌接種量太多，則會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，使產(chǎn)品酸度過(guò)高，影響成品酒風(fēng)味[12-13]。從表6可知，混合接種量為8%時(shí)，成品酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到了20.6%，產(chǎn)品口味及香氣適宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蒸餾奶酒發(fā)酵工藝

2.2.1 模型的建立及方差分析

模型的建立及方差分析，見(jiàn)表7。

對(duì)表7的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多元回歸方程（模型）：

該模型進(jìn)行方差分析結(jié)果見(jiàn)表8，模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表9。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Results of Box-Behnken central composite design

表8 回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of the developed regression equation

從表8可以看出，該模型極顯著（P<0.01）；因變量與自變量之間的線性關(guān)系以及平方、交互作用極顯著（P<0.01）；失擬度不顯著（P>0.05），表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合良好，可用此模型對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

由表9回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型中接入乳酸菌時(shí)間、混合接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響極顯著（各二次項(xiàng)P<0.01）；初始糖度對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響顯著（二次項(xiàng)P<0.05）；初始糖度與接入乳酸菌時(shí)間、初始糖度與混合接種量、初始pH與接入乳酸菌時(shí)間的交互作用顯著（P<0.05）；接入乳酸菌時(shí)間與混合接種量的交互作用極顯著（P<0.01）。

表9 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 9 The significant test of regression coefficients

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

初始糖度和初始pH對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響，見(jiàn)圖1。

圖1 初始糖度和初始pH對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of initial sugar content and initial pH value on the alcoholicity

從圖1可以看出，隨著初始糖度的升高酒精體積分?jǐn)?shù)先上升后下降，不受初始pH的交互作用的影響。初始糖度和接入乳酸菌時(shí)間對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響，見(jiàn)圖2?？梢钥闯觯跏继嵌葘?duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響受接入乳酸菌時(shí)間的交互作用的影響，較早接入乳酸菌時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨初始糖度的升高而降低；較晚接入乳酸菌時(shí)，初始糖度升高，酒精體積分?jǐn)?shù)升高。

初始糖度和混合接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響，見(jiàn)圖3。

圖2 初始糖度和接入乳酸菌時(shí)間對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of initial sugar content and the time that inoculate lactobacillus on the alcoholicity

圖3 初始糖度和混合接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of initial sugar content and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

由圖3可知，初始糖度對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響受混合菌種接種量交互作用的影響，混合菌種接種量較低時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨初始糖度升高而降低；混合菌種接種量較高時(shí)，初始糖度升高，酒精體積分?jǐn)?shù)升高。

初始pH和接入乳酸菌時(shí)間對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響，見(jiàn)圖4。

圖4 初始pH和接入乳酸菌時(shí)間對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of initial pH value and the time that inoculate lactobacillus on the alcoholicity

由圖4可知，初始pH對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響受接入乳酸菌時(shí)間的交互作用的影響，較早接入乳酸菌時(shí)，酒精體積分?jǐn)?shù)隨初始pH的升高而升高；較晚接入乳酸菌時(shí)，初始pH升高，酒精體積分?jǐn)?shù)降低。

初始pH和混合接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響，見(jiàn)圖5。

圖5 初始pH和混合接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of initial pH value and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

從圖5可以看出，隨初始pH的升高酒精體積分?jǐn)?shù)先升高后下降，不受混合菌種接種量交互作用的影響。接入乳酸菌時(shí)間和混合接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響，見(jiàn)圖6。

從圖6可以看出，接入乳酸菌時(shí)間對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響受混合菌種接種量的交互作用的影響。

圖6 接入乳酸菌時(shí)間和混合接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.6 Effect of the time that inoculate lactobacillus and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

2.2.3 工藝優(yōu)化和驗(yàn)證性試驗(yàn)

由回歸方程確定的最優(yōu)工藝條件為：初始糖度19.31 °Bx，初始pH4.41，酵母單獨(dú)發(fā)酵26.06 h后接入乳酸菌，混合接種量8.34%，在此條件下成品酒酒精體積分?jǐn)?shù)的最大預(yù)測(cè)值為21.64%?？紤]實(shí)際操作性，將發(fā)酵工藝參數(shù)修正為：初始糖度19.3°Bx，初始pH4.4，酵母菌單獨(dú)發(fā)酵26 h后接入乳酸菌，混合接種量8.3%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，成品酒酒精體積分?jǐn)?shù)為20.8%，符合率達(dá)96.12%，說(shuō)明優(yōu)化工藝的模型有效。

2.3 成品酒質(zhì)量指標(biāo)

2.3.1 感官指標(biāo)

清亮透明；有純正、清雅、和諧的乳香和酒香；綿甜醇和，無(wú)異味；具有本品突出的風(fēng)格。

2.3.2 理化指標(biāo)

酒精度(體積分?jǐn)?shù))/%：15～20；總酸（以乙酸計(jì)）/（g/L）:0.3～0.6；總酯（以乙酸乙酯計(jì)）/（g/L）：0.6～0.8。

2.3.3 衛(wèi)生指標(biāo)

甲醇/（g/L）≤0.40；雜醇油/（g/L）≤1.50。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化蒸餾型牛奶酒發(fā)酵工藝，得出的優(yōu)化工藝條件為：初始糖度19.3°Bx，初始pH4.4，酵母單獨(dú)發(fā)酵26 h后接入乳酸菌，混合接種量8.3%。在此條件下，產(chǎn)品的酒精體積分?jǐn)?shù)為20.8%。試驗(yàn)建立的二次回歸模型對(duì)試驗(yàn)擬合較好。所得的成酒奶香酒香濃郁，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的保健酒，開(kāi)發(fā)前景廣闊。

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