國外茁霉多糖上游處理研究現狀及進展

蘇安祥，馮印，劉杰，王玉華

（吉林農業(yè)大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

國外茁霉多糖上游處理研究現狀及進展

蘇安祥，馮印，劉杰，王玉華*

（吉林農業(yè)大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

茁霉多糖（Pullulan）是一種水溶性胞外中性多糖，由真菌出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）發(fā)酵生產的。茁霉多糖在食品工業(yè)、藥品等領域有廣泛的應用，是一種很有前景的多糖，但是大規(guī)模生產的還很少，主要原因有兩個，一個是產量低，另一個是多糖中色素難以除去。綜述茁霉多糖的生產菌種、生物合成機理，培養(yǎng)條件的最新研究成果，同時討論了茁霉多糖的應用前景和研究熱點。

茁霉多糖；微生物來源；合成機理；培養(yǎng)條件

茁霉多糖是由出芽短梗霉生產的一種微生物多糖。它是一種白色粉末，無味，無臭，無毒，極易溶于水，可塑性極強，具有良好的成膜性，膜具有光澤而透明，透氣性較其他高分子膜低，具有更好的阻隔氧氣的性能。茁霉多糖已廣泛應于醫(yī)藥、食品、化妝、輕工和石油等領域，是一種非常有前景的新型多糖。但是在發(fā)酵生產中的一個缺點是產量低并且在發(fā)酵生產中分泌一種黑色素類化合物。另外一個缺點是，出芽短梗霉隨著發(fā)酵的進行，胞外多糖的平均分子量會減小，黏度降低，并且發(fā)酵液中底物糖用盡后茁霉多糖被分解以維持細胞的生長發(fā)育，正是這些問題阻礙著茁霉多糖的生產。近年來引起了國外學者的廣泛關注，發(fā)表了許多關于微生物來源、結構、上游處理、下游加工以及應用等方面的文章。本文將對國外有關茁霉多糖生物合成機理、生產菌種、培養(yǎng)條件的研究現狀和進展進行回顧和討論。

1 生物合成的機理研究

茁霉多糖的生產是在對數期后期和穩(wěn)定期的前期。Catley[1]首先發(fā)現，在菌絲體轉變成酵母狀細胞形式時茁霉多糖出現，據此推斷酵母狀細胞獨立負責茁霉多糖的加工。有研究證明了這種理論，因為在有利于酵母狀細胞形態(tài)生長的條件下多糖產量最大。有數據顯示溶漲細胞以及厚膜孢子的形成和茁霉多糖形成是同時的。Simon等提出，不論菌絲形式細胞合成何種多糖，都不是茁霉多糖。當大量的厚膜孢子出現時，無論培養(yǎng)基是何種條件都一直進行茁霉多糖的加工。Yurlova等認為，菌絲體細胞形式也可以產生胞外多糖，而Seviour等認為多糖生產不和任何形態(tài)的轉變相聯系。Campbell等最近研究顯示，厚膜孢子和溶漲細胞分泌多糖，但是分生孢子或菌絲體不分泌。有些研究之間是相互沖突的，這可能是因為茁霉多糖的生產受多種因素的影響。

研究人員還提出了幾種關于茁霉多糖是如何加工的理論。關于各種出芽短梗霉菌株生物合成茁霉多糖的各種性質特點的完整論述出版于1981年。Catley[2]在1971年提出一個類脂是茁霉多糖運到細胞膜外的載體。Lee和Simon等的研究證明了這一觀點。Rho等[3]提出了2個途徑，一個是直接由葡萄糖轉換，第2個是從確定的前體轉化。Simon等[4]研究提出，茁霉多糖和不溶性多糖都集中在厚膜孢子的外表面上，如圖1。

最外層是密集的多糖層，里面包著一層由葡萄糖和甘露糖通過β－1，3－糖苷鍵連接而成的不溶性的多聚糖層。Simon等[5]1998年研究表明，茁霉多糖在胞外的聚集和細胞內糖原濃度呈現負相關，但是糖原如何轉化茁霉多糖的機制還沒有搞清楚。

Catley和McDowell在總結各自研究結果和數據的基礎上，提出下面的茁霉多糖生物合成的途徑[6]。第一步是UDPG（尿苷二磷酸葡糖）把一個D－葡萄糖基轉到脂質磷酸（L－P）上形成焦磷酸葡糖（L－P－P－G），然后再轉移一個D－葡萄糖基形成脂質鍵合的異麥芽糖（L－PP－G6－G1）和麥芽糖基（L－P－P－G4－G1），接著再從UDPG轉移一個D－葡萄糖，或用L－P－P－G上的葡糖基與脂質鍵合的異麥芽糖基作用，生成脂質鍵合的異潘糖基和潘糖基（中間體，見圖2），最后這些活性的異潘糖基和潘糖基相互聚合，形成茁霉多糖鏈，見圖3。

2 菌種

有關茁霉多糖生產菌種報道最多的是出芽短梗霉（A.pullulans），出芽短梗霉（A.pullulans）是一種普遍存在的由環(huán)境分離的真菌。它們生長于土壤、水和腐生物的腐爛葉、亂拋垃圾等。大部分出芽短梗霉能夠生產茁霉多糖，但不是全部。除出芽短梗霉外，其他有報道的一些生產茁霉多糖的微生物總結見表1。

表 1 茁霉多糖主要生產菌株Table 1 Microbial sources of pullulan

茁霉多糖產生菌在腐生菌銀耳腸膜菌Tremellamesenterica[7]，寄生真菌Cytaria harioti和C.darwinii[8-9]和板栗枯萎病真菌、寄生藻類菌Cryphonectria parasitica[10]中（這是第1次報道寄生藻類菌生產茁霉多糖）也有分離。從子囊菌中分離到的多糖，類似于從出芽短梗霉腸膜菌素中分離到的多糖，其鍵1∶1的比例不同于眾所周知的出芽短梗霉產生的茁霉多糖2∶1[11]。一個從中國植物葉片中分離得到的酵母菌—紅酵母，報道稱茁霉多糖產量高并且未產生黑色素[12]。那淑敏[13]從加拿大切峰蟲繭上分離到菌株A22，其按照Hermanides－Nijhhof分類系統(tǒng)，與出芽短梗霉變種（A.pullulans Am.Var.pullulans）相似。Pollock等[14]從San Diego的一種植物樹葉表面分離到一種出芽短梗霉菌株，能生產高分子量的茁霉多糖，同時色素產量大大降低。此外，S.Prasongsuk等[15]還對泰國土壤中的出芽短梗霉菌株進行研究，希望能獲得低色素高產的茁霉多糖。S V N Vijayendra等[16]對出芽短梗霉CFR-77菌株進行研究，以5%椰子樹汁制得的粗糖為唯一碳源，發(fā)酵過程中細胞始終呈酵母狀并帶有厚垣孢子，菌體不產生色素，發(fā)酵72 h產量達到51.9 g/L，此菌株發(fā)酵周期短，多糖產量高且黏性好。Hyung-Pil Seo等[17]對出芽短梗霉ATCC4202進行紫外誘變，得到誘變株出芽短梗霉HP－2001，該菌株發(fā)酵時無色素產生，所產的高分子量普魯藍多糖不會因糖濃度的升高而被分解。

3 培養(yǎng)條件

糖類如蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、淀粉、低聚糖都可以作為出芽短梗霉的碳源，而木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、乳糖，雖然使用的很少但也可以作為碳源，只是多糖的產量低。而丙三醇在有誘導葡萄糖存在的條件下也可以作為碳源，誘導作用會被放線菌酮抑制，這表明合成新蛋白質是一個必不可少的步驟。葡萄糖果糖或者能降解成這些糖的糖類都可以用作碳源。

Schuster等[18]以不產黑色素的出芽短梗霉突變株研究不同碳源（蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和乳糖等）對茁霉多糖產量的影響，發(fā)現不同的碳源間存在顯著的差異，蔗糖為最佳碳源。Gniewosa等[19]比較了11種5%濃度的碳源對出芽短梗霉AP3合成茁霉多糖的影響,蔗糖為最佳碳源，發(fā)酵5 d茁霉多糖濃度最高,其次為麥芽糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和果糖，以核糖、阿拉伯糖、半乳糖和淀粉為碳源時,茁霉多糖產量較低。Kato等[20]發(fā)現在20%麥芽糖的水解產物中,出芽短梗霉發(fā)酵的茁霉多糖的濃度比在葡萄糖漿中得到的高115%。其它的農業(yè)和食品工業(yè)的廢棄物，如去蛋白乳清、甜菜糖漿、甜甘蔗汁、泥炭水解物、乙醇發(fā)酵廢液葡萄皮漿都是生產茁霉多糖既經濟又高效的底物。

碳源濃度對多糖生產也有影響，濃度太低會成為限制因素，濃度太高又會產生抑制作用。Le Duy[21]以甜菜糖漿為發(fā)酵底物，發(fā)現在糖漿起始濃度為50 g/L～100 g/L的范圍內，隨著糖漿濃度增加，茁霉多糖的濃度也逐漸增高，但如果進一步增加糖漿濃度，茁霉多糖濃度反而降低。這種下降可能是因為在發(fā)酵后期，菌絲產生1種內生葡糖糖化酶（又叫葡糖糖化酶B），它不僅可以降解淀粉，還可以降解茁霉多糖。

生物反應器的設計和氮源會影響茁霉多糖的生產，但不會影響出芽短梗霉的細胞形態(tài),銨和復合氮源比用硝酸鹽要好。Lee和Yoo[22]發(fā)現初始pH6.0時多糖產量最高。另據報道，pH4.5時最適合多糖生產，pH6.5最適合酵母狀細胞的生長[23]。茁霉多糖生產的最適溫度是24℃～30℃，不同菌株間有微小差異。Bender[24]報道稱VB1可以增加多糖的產量。生物素、氯化鐵、氯化錳和氯化鋅也可以增加多糖的產量[25-26]。

出芽短梗霉是需氧發(fā)酵的，通氣量對多糖產量有重要的影響。在無氧條件下發(fā)酵,細胞既不生長也不分泌多糖,而大量通氣則可以顯著提高多糖的濃度。這種影響在富含氮的介質中很明顯,而在缺氮源的介質中，大量通氣,會抑制茁霉多糖的生成[27]。Audet等[28]認為在營養(yǎng)均衡的介質中，雖然提高溶解氧的濃度，產率也隨之增高，但是大量通氣時應當謹慎，因為通氣過大，分子質量會降低。Dufresne等[29]發(fā)現茁霉多糖產量與氧氣的分壓關系很復雜：隨著氧氣分壓的增加，茁霉多糖產量升高，但是增到一定值后會迅速降低。Dufresne在試驗中還發(fā)現通過增大氣體分壓使氧氣利用率增大，可以改進出芽短梗霉生產多糖的活性，高的氣流量和大的工作壓有益于細胞本體的生長和茁霉多糖的生成。

攪拌速度過高和過低都會降低多糖的產量。Lazaridou[30]發(fā)現在攪拌速度為300 r/min～700 r/min范圍內，茁霉多糖的濃度有明顯增高，在700 r/min時多糖濃度達到最大值，此后，再增加攪拌速度，多糖濃度反而下降。Simon[31]發(fā)現在攪拌速度450 r/min，通氣量小于175 L/h時，茁霉多糖的產量最高；而Gibbs和Seviour[32]也發(fā)現攪拌速度過大如750r/min，茁霉多糖的濃度會下降。

Miure等以蔗糖為底物研究發(fā)現，如果在發(fā)酵體系中加入淀粉酶抑制劑，可以抑制后期酶對茁霉多糖的分解，并且得到的茁霉多糖分子量較大。為解決常規(guī)發(fā)酵生產茁霉多糖伴隨的一些問題，避免氧限制，形態(tài)轉變及形成色素等難題，Schabtai等[33]建立了雙相發(fā)酵工藝，這種發(fā)酵工藝較單底物發(fā)酵時間短，產量高，可以用酵母狀真菌出芽短梗霉生產無色素的茁霉多糖。

許多學者研究了分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵。近年來許多學者開始研究固定發(fā)酵的方法。Urkut等[34]對P56菌株用合成的培養(yǎng)基在海藻酸鈣凝膠球中固定化發(fā)酵，結果表明這種方法適合分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵。

響應面分析法（RSM）是一種新的較好的方法。許多學者用此方法來優(yōu)化茁霉多糖的生產條件。Goksungur等用響應面分析法對P56菌株游離細胞在攪拌釜反應器中進行了試驗，考察了糖濃度、攪動速度、通氣量3個因素。Thibault等通過搖瓶試驗調查了菌株、碳源、氮源、氮濃度、通氣量、初始pH 6個因素對茁霉多糖產量的影響，分析主要因素的影響及因素之間的相互作用，并且用經驗模型優(yōu)化了6個因素。Urkut等[34]用響應面分析法對固定化分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵進行研究，分析初始pH，攪動速率、培養(yǎng)時間3個參數，在試驗中海藻酸鈣凝膠球固定化菌種在重復發(fā)酵中用了6輪，沒有出現活力的明顯損失。

4 結論與展望

與發(fā)達國家相比我國的茁霉多糖研究非常落后，1976年～1980年是第1個研究高峰，主要針對其性質和發(fā)酵方法的研究。1984年～1996年是第2個研究高峰，主要集中在對其產生機理和應用研究。日本2009年產量已超萬t，從20世紀70年代中期開始生產到現在，日本（主要是日本某一個公司）仍然壟斷國際市場。我國國內學者現在主要在研究菌株的篩選，而培養(yǎng)基的優(yōu)化方面，需要進一步深入研究。

另外，我們在篩選高產菌株和不產黑色素菌株的同時，可以開拓一下思路，可以利用黑色素，據報道天然黑色素不僅可以用于食用色素添加劑，在化妝品、染發(fā)劑的裝飾、防紫外輻射、清除自由基以及生物殺蟲劑的光保護等方面應用也比較廣泛。目前市場上紅色素、黃色素比較多，天然黑色素還較為罕見。許多研究者一直對出芽短梗霉發(fā)酵過程中的黑色素作為雜質去除，忽視了黑色素可作為一種天然色素加以開發(fā)和應用。有學者還發(fā)現，在用出芽短梗霉生產多糖時，不僅可以利用工業(yè)廢棄物作為底物，還可以用一些已知結構的葡萄糖類似物如3－甲氧基－葡萄糖，D－葡萄糖胺和N－乙酰－D－葡萄糖胺作為底物，一些菌株可以單一的生成含葡聚糖和甘露聚糖。

總之，這方面的研究具有很大的開發(fā)潛力和經濟價值，深入研究，充分利用好，使之產業(yè)化，對于我們這樣一個有著豐富資源的農業(yè)大國來說有著重要的意義。

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Research Progress of Upstream Processing of Pullulan Abroad

SU An－xiang，FENG Yin，LIU Jie，WANG Yu－h(huán)ua*
（School of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，Jilin，China）

Pullulan，a neutral water－soluble extracellular polysaccharide，is obtained by fermentation using a fungus，Aureobasidium pullulans.Pullulan was widely used in food industrial，pharmaceutical industrial and other commercial and industrial areas.It was a promising polysaccharide.But mass production is also small，for two main reasons，one is low yield and the other is difficult to remove the polysaccharide pigment.The latest advances on the study of the microbial sources，synthesis mechanism and culture conditions were reviewed.Its industrial applications and current research focus were discussed.

pullulan；microbial sources；synthesis mechanism；culture conditions

吉林省科技廳科技支撐計劃（20080251）

蘇安祥（1984—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：食品微生物與功能性食品。

*通信作者：王玉華（1972—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品微生物與功能性食品。

2011-07-01