高效液相色譜法測定銀杏葉提取物中的黃酮醇苷

楊金鑫，常 薇，劉伶文，王曉軍

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048)

0 引 言

銀杏葉提取物(EGB)為銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的干燥葉經(jīng)加工制成的提取物[1],EGB的藥用價值與應(yīng)用極為廣泛。采用先進(jìn)的技術(shù)、工藝和設(shè)備，通過進(jìn)一步提取、分離和純化，其藥理作用更加明顯，除具有顯著的拮抗PAF受體[2]外，在抗過敏、保護(hù)心腦血管、改善外周血液循環(huán)、降低血清膽固醇及輔助抗癌等方面也發(fā)揮明顯藥效，能有效地清除自由基活性[3-4]，被廣泛應(yīng)用于心腦血管、神經(jīng)等系統(tǒng)疾病的防治和保健[5]。黃酮類化合物是一類種類復(fù)雜的天然酚類化合物，廣泛存在于植物中[6-7]。銀杏葉提取物中的有效成分主要有黃酮醇苷類化合物和萜類化合物[8]，此外還有有機(jī)酸類、酚類、聚戊烯醇類等[9]。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結(jié)合成苷類，小部分以游離態(tài)(苷元)的形式存在，其中槲皮素、山奈素、異鼠李素為黃酮類化合物的3種糖苷成分[10]。

黃酮類化合物具有很多的藥理活性，黃酮類化合物的提取以及測定已經(jīng)成為當(dāng)今生物化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的重要研究領(lǐng)域。測定黃酮類化合物有分光光度法[11-13]、熒光光度法[14-16]、HPLC法[17-18]、毛細(xì)管電泳法[19]等。分光光度法利用生成顯色絡(luò)合物的特性測定總黃酮含量，但精度不高；毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測法中，電滲流會因樣品組成的改變而變化，從而影響組分分離的重現(xiàn)性；熒光光度法由于使用緩沖液使得測定結(jié)果受pH影響較大。而HPLC法具有分離性能好、檢測分析速度快、選擇性高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，已成為黃酮類化合物含量測定的重要方法[20]。

本文通過進(jìn)一步優(yōu)化測定條件，建立了高效液相色譜法測定銀杏葉提取物中黃酮醇苷類物質(zhì)中槲皮素、山奈素、異鼠李素含量的方法，該方法不僅可測定銀杏葉提取物中黃酮醇苷類物質(zhì)的含量，還可通過換算系數(shù)得到銀杏葉提取物中的總黃酮醇苷含量。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(安捷倫公司)；KQ-250DA型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲)；HWCL-3集熱式恒溫磁力攪拌浴(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FA1104N型電子分析天平。槲皮素、山奈酚、異鼠李素(標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；銀杏葉提取物；甲醇、乙腈(均為色譜純)；超純水。

1.2 試劑的制備

1.2.1 樣品溶液的準(zhǔn)備 準(zhǔn)確稱取100 mg銀杏葉提取物放入100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL甲醇和20 mL、1.5 moL/L的鹽酸溶液，超聲10 min，然后加熱回流2 h，冷卻至室溫后將溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻靜置待測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 分別準(zhǔn)確稱取槲皮素、山奈素、異鼠李素20 mg，經(jīng)甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，得到質(zhì)量濃度分別為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放置冰箱保存。

1.3 總黃酮醇苷含量的計算

銀杏葉提取物中的黃酮類化合物主要以黃酮醇苷的形式存在，通過水解黃酮醇苷轉(zhuǎn)化為苷元，再以槲皮素、山奈素、異鼠李素為對照品通過外標(biāo)法計算出3種物質(zhì)的含量。采用換算系數(shù)2.57計算總黃酮醇苷的含量以及各成分所占百分比，其中，總黃酮醇苷含量=2.57×(槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相條件的優(yōu)化

選用4種不同的流動相：V(甲醇)∶V(水)=60∶40、V(甲醇)∶V(水)=50∶50、V(甲醇)∶V(水)=55∶45、V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=60∶35∶5，對66.67 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在檢測波長為370 nm、進(jìn)樣量10 μL、柱溫25 ℃條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，在3種不同流動相下，槲皮素、山奈素、異鼠李素3種物質(zhì)均能得到較好的分離。然而，加入乙腈的流動相保留時間縮短且峰面積顯著增強，測定結(jié)果也更加準(zhǔn)確，主要是因為甲醇為類質(zhì)子溶劑，可與黃酮醇苷化合物形成氫鍵，提高了分離選擇性。而乙腈的極性比甲醇小，流動相的極性越小，洗脫能力就越強。所以在加入少量乙腈的情況下，流動相的洗脫能力更強，導(dǎo)致保留時間縮短，因而選用V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=60∶35∶5的流動相。

(a)V(甲醇)∶V(水)=60∶40 (b)V(甲醇)∶V(水)=50∶50

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線以及檢測限、定量限的測定

準(zhǔn)確移取槲皮素、異鼠李素及山奈素對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入甲醇稀釋配成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)行色譜分析。以各標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍如表1所示，將色譜圖中保留時間為5.5～6.5 min的基線作為噪聲信號，經(jīng)測定得到檢測限(LOD)及定量限(LOQ)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及檢測限、定量限

2.3 樣品的測定

在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定條件下，即流動相為V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=60∶35∶5、柱溫25 ℃、檢測波長370 nm、進(jìn)樣量10 μL條件下進(jìn)行色譜分析，色譜流出曲線如圖2所示。

(1)—槲皮素;(2)—異鼠李素;(3)—山奈素

根據(jù)表1標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中槲皮素含量為0.98%，異鼠李素含量為0.15%，山奈素的含量為0.001 3%。然后根據(jù)換算系數(shù)計算得黃酮醇苷含量為2.91%。

2.4 精密度及加標(biāo)回收率

取1 mL樣品溶液加入0.3 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，進(jìn)行6次平行實驗后分別求出槲皮素、異鼠李素、山奈素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%、0.81%、1.61%。三者的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差都在2%以下，表明測定結(jié)果精密度良好。

在銀杏葉提取物樣品溶液中分別加入0.3 mL、20 μg/mL，0.6 mL、40 μg/mL，0.75 mL、50 μg/mL的混標(biāo)溶液，對加入混標(biāo)溶液后的樣品進(jìn)行測定，通過對比實際測量值和理論值計算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 加標(biāo)回收率

在9組數(shù)據(jù)中，槲皮素、異鼠李素和山奈素的平均加標(biāo)回收率分別為99.26%、100.1%、100.35%，平均回收率在99%～101%，表明實驗檢測方法可行，具有較高的測定準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 論

1)V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=60∶35∶5的流動相產(chǎn)生的峰形良好，保留時間短，方法簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確。

2)在檢測濃度范圍內(nèi)，槲皮素、異鼠李素、山奈素均具有良好的線性關(guān)系。通過該法測得銀杏葉提取物樣品中總黃酮醇苷含量為2.91%，三者的平均回收率分別為99.26%、100.1%、100.35%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤2%，滿足實驗室的測定要求。

3)該方法操作簡便，可用于銀杏葉提取物中黃酮醇苷類化合物的準(zhǔn)確測定，對于銀杏葉提取物中黃酮醇苷類化合物的進(jìn)一步應(yīng)用和開發(fā)提供依據(jù)。