基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制

李偉 李春根 穆曉紅 陳黎明 陳琛 趙子義

摘要?目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。方法：通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、中藥分子機(jī)制綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索金匱腎氣丸藥物成分及成分相關(guān)靶點(diǎn);以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）、DrugBank等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索骨質(zhì)疏松癥疾病相關(guān)靶點(diǎn);制作韋恩圖，獲取藥物-疾病交集靶點(diǎn);利用String數(shù)據(jù)庫(kù)、Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建藥物-疾病交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò);通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）、京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析，并將富集結(jié)果可視化。結(jié)果：共獲得金匱腎氣丸藥物成分118個(gè)，包括槲皮素、山柰酚、大黃素等;有效成分相關(guān)靶點(diǎn)202個(gè)，疾病相關(guān)靶點(diǎn)1 856個(gè)，藥物-疾病交集靶點(diǎn)87個(gè)，包括前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、胞間黏附分子1（ICAM1）等;GO富集分析功能條目376條，其中生物過(guò)程（BP）290條，細(xì)胞組分（CC）28條，分子功能（MF）58條，包括RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、類固醇激素受體活性等;KEGG信號(hào)通路共90條，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、催乳激素信號(hào)通路等。結(jié)論：金匱腎氣丸通過(guò)槲皮素、山柰酚、大黃素、薯蕷皂苷元、β-谷甾醇等有效成分作用于PTGS2、JUN、ICAM1、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）等關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、抑制破骨細(xì)胞骨吸收等作用機(jī)制達(dá)到治療OP的作用。

關(guān)鍵詞?金匱腎氣丸;骨質(zhì)疏松癥;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);藥物成分;作用靶點(diǎn);信號(hào)通路;作用機(jī)制

Abstract?To predict the mechanism of Jinkui Shenqi Pill in the treatment of osteoporosis based on network pharmacology.Methods TCMSP，TCMID，BATMAN-TCM databases were used to retrieve the drug components and related targets of Jinkui Shenqi pill; the related targets of osteoporosis were searched in GeneCards，OMIM，DrugBank databases with the key word of “osteoporosis”; the common target of the drug-disease were obtained by generating Venny diagrams; string database and Cytoscape 3.6.1 software were used to construct the drug-disease common target protein interaction network and drug-component-disease-target network; finally，GO and KEGG enrichment analysis of common target were carried out through David database，and the enrichment results were visualized.Result A total of 118 chemical components from Jinkui Shenqi pill were obtained，including quercetin，kaempferol，emodin，etc.; there were 202 active component related targets，1856 disease-related targets and 87 drug-disease common targets，including PTGS2，JUN，ICAM1，etc.; there were 376 functional items analyzed by GO enrichment analysis，namely 290 biological processes （BP），28 cellular components （CC） and 58 molecular functions （MF），including the positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter and steroid hormone receptor activity; there were 90 KEGG signaling pathways，mainly including rheumatoid arthritis signaling pathway，osteoclast differentiation signaling pathway，prolactin signaling pathway，etc.Conclusion Jinkui Shenqi Pill functions mainly through quercetin，kaempferol，emodin，diosgenin and beta-sitosterol on key target genes of PTGS2，JUN，ICAM1，IL1B and MMP9 through the mechanism of anti-oxidation，inhibition of inflammatory reaction，promotion of osteoblast proliferation and differentiation，inhibition of osteoclast bone absorption，and finally achieve the therapeutic effect of treat OP.

Keywords?Jinkui Shenqi Pill; Osteoporosis; Network pharmacology; Drug components; Target of action; Signaling pathway; Mechanism of action

中圖分類號(hào)：R285;R274.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.004

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種復(fù)雜的全身性的骨代謝性疾病，其基本機(jī)制是骨吸收與骨形成的失衡，主要表現(xiàn)為骨密度、骨量的降低及其骨骼細(xì)微結(jié)構(gòu)的改變[1]。隨著我國(guó)社會(huì)老齡化的加深，OP的發(fā)病率逐年升高，據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，OP在我國(guó)的發(fā)病率為13%[2]，隨之而來(lái)的骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率也逐年攀升，給社會(huì)及家庭帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)OP的發(fā)病原因與機(jī)體代謝異常、基因多態(tài)性、微循環(huán)障礙等因素密切相關(guān)[3-4]。治療主要以抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成為原則，目前常用的治療藥物主要有雙磷酸鹽類、降鈣素類、雌激素替代治療、維生素D及鈣類等，但是長(zhǎng)期使用以上藥物存在胃腸道不良反應(yīng)、肝腎功能損害、心血管疾病及子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn)增加、腎結(jié)石等不良反應(yīng)[5-6]。因此急需尋求一種療效顯著、不良反應(yīng)少、可以長(zhǎng)期使用的預(yù)防與治療OP的藥物，中醫(yī)藥具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)并沒(méi)有OP的病名，多將其歸屬于“骨痹”“骨萎”等范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為腎主骨生髓，腎虛，腎精不足，骨髓失養(yǎng)，終成萎痹，治療當(dāng)以“填精益髓，補(bǔ)腎壯骨”為原則[7]。金匱腎氣丸出自《金匱要略》，是溫補(bǔ)腎精的經(jīng)典方劑，在治療OP等疾病方面具有顯著的臨床療效。研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸能提高血清雌激素水平，改善骨密度與成骨細(xì)胞功能，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化，減輕OP患者疼痛癥狀等[8]。目前，金匱腎氣丸治療OP的主要活性成分及具體作用機(jī)制未見(jiàn)系統(tǒng)的描述。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科，是基于分子層面，通過(guò)數(shù)據(jù)可視化分析，構(gòu)建藥物-有效成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)來(lái)預(yù)測(cè)藥物治療疾病的作用機(jī)制，彌補(bǔ)了“單成分、單靶點(diǎn)、單藥物、單疾病”研究模式的不足。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松的有效成分、作用靶點(diǎn)、關(guān)鍵通路，并解釋其作用機(jī)制。

1?資料與方法

1.1?“金匱腎氣丸”藥物化學(xué)成分及其相關(guān)靶點(diǎn)的搜集?采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中藥分子機(jī)制綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID）、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（A Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）檢索金匱腎氣丸組成藥物活性化學(xué)成分，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Like，DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有活性成分進(jìn)行篩選，并搜集有效化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2?“骨質(zhì)疏松癥”疾病靶點(diǎn)的搜集?通過(guò)人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞搜集骨質(zhì)疏松癥的疾病靶點(diǎn)。刪除重復(fù)的靶點(diǎn)，導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3?藥物-疾病交集靶點(diǎn)、韋恩圖及活性成分-作用靶點(diǎn)的構(gòu)建?將“金匱腎氣丸”有效成分相關(guān)靶點(diǎn)及“骨質(zhì)疏松癥”疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0在線作圖工具獲得藥物-疾病交集靶點(diǎn)及其韋恩圖并將其交集靶點(diǎn)、有效成分導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，對(duì)藥物有效成分相關(guān)靶點(diǎn)-疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖?；钚猿煞?、作用靶點(diǎn)用“節(jié)點(diǎn)”表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系用“邊”表示。

1.4?蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建?將藥物-疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING軟件中（https：//string-db.org），選擇置信度score≥0.700，隱藏游離的節(jié)點(diǎn)。下載TSV數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析，使用CytoHubba插件的MCC算法找出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的核心基因。

1.5?富集分析

采用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物、疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為P值小于0.05，使用imageGP作圖軟件對(duì)P-value值最小的GO生物功能前20條及KEGG信號(hào)通路前30條結(jié)果制作氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

2?結(jié)果

2.1?“金匱腎氣丸”藥物化學(xué)成分及其相關(guān)靶點(diǎn)?通過(guò)TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM共3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)檢索，共獲得金匱腎氣丸藥物化學(xué)成分118個(gè)，其中茯苓15個(gè)，附子21個(gè)，桂枝7個(gè)，牡丹皮11個(gè)，山藥16個(gè)，山茱萸20個(gè)，熟地黃2個(gè)，澤瀉26個(gè);共獲取相關(guān)靶點(diǎn)569個(gè)，刪除重復(fù)的靶點(diǎn)，最終獲得金匱腎氣丸組成藥物化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)202個(gè)。

2.2?“骨質(zhì)疏松癥”疾病靶點(diǎn)搜索結(jié)果?通過(guò)GeneCards、OMIM、DrugBank等數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，獲得疾病靶點(diǎn)4 305個(gè)，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)4 273個(gè)，OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)共32個(gè)，取GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)Relevance score分?jǐn)?shù)≥中位數(shù)1.87的靶點(diǎn)共2 751個(gè)，刪除3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)的靶點(diǎn)，最終獲得骨質(zhì)疏松癥疾病靶點(diǎn)1 856個(gè)。

2.3?藥物-疾病交集靶點(diǎn)、韋恩圖及藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)?將金匱腎氣丸藥物成分相關(guān)靶點(diǎn)、骨質(zhì)疏松癥疾病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0在線作圖工具，共獲得鹽皮質(zhì)激素受體（Mineralocorticoid Receptor，NR3C2）、黃體酮受體（Progesterone Receptor，PGR）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2，PTGS2）、視黃酸受體（Reti-noic Acid Receptor RXR-Alpha，RXRA）等87個(gè)交集靶點(diǎn)及韋恩圖。見(jiàn)圖1。將藥物-疾病交集靶點(diǎn)與藥物有效成分相互作用關(guān)系及屬性文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件并進(jìn)行映射，構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)Cytoscape軟件NetworkAnalyzer分析工具算出有效成分Degree值，Degree值越大表示節(jié)點(diǎn)的重要性越大。見(jiàn)圖2。藥物有效成分Degree值位于前5位的分別為槲皮素（Quercetin）為66，山柰酚（Kaempferol）為25，大黃素（Emodin）為16，薯蕷皂苷元（Diosgenin）為10，Β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）為9。見(jiàn)表1。

2.4?PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

將藥物-疾病的87個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING軟件中，擇置信度Score≥0.700，下載TSV數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，共得到87個(gè)節(jié)點(diǎn)，634條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為14.6，使用cytoHubba插件的MCC算法找出PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因，PTGS2、JUN、ICAM1、IL1B、MMP9等基因?yàn)镻PI網(wǎng)絡(luò)核心基因。見(jiàn)圖3、圖4。

2.5?金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥作用靶點(diǎn)GO生物功能富集分析結(jié)果?采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物功能富集分析，共獲得P值小于0.05的GO功能條目376條，其中生物過(guò)程（Biological Process，BP）290條，細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）28條，分子功能（Molecular Function，MF）58條。生物過(guò)程主要富集在轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板化、對(duì)藥物的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)控等;細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、膜筏、質(zhì)膜小凹、核染色質(zhì)等;分子功能主要富集在酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞因子活性等。見(jiàn)圖5～7。

2.6?金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥作用靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果?通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，共獲得P值小于0.05的KEGG信號(hào)通路90條，刪除“Cancer”相關(guān)通路，根據(jù)P值對(duì)前30條信號(hào)通路繪制氣泡圖。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、催乳激素信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路是金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵通路。見(jiàn)圖8。前10位信號(hào)通路富集細(xì)節(jié)。見(jiàn)表2。

3?討論

骨質(zhì)疏松癥的病機(jī)為腎虛，腎精不足，骨髓失養(yǎng)。治療當(dāng)以“填精益髓，補(bǔ)腎壯骨”為原則。金匱腎氣丸源自《金匱要略》，在治療OP等疾病取得了較好的臨床療效。方中熟地黃滋陰補(bǔ)腎、填精益髓，桂枝、附子溫補(bǔ)陽(yáng)氣，溫陽(yáng)化氣共為君藥;山茱萸補(bǔ)腎壯骨、固腎澀精，山藥健脾益氣，滋陰助陽(yáng)共為臣藥;茯苓、澤瀉、牡丹皮清熱養(yǎng)陰、健脾化濕、補(bǔ)而不壅。諸藥配伍，共奏填精益髓、強(qiáng)筋健骨、陰陽(yáng)雙補(bǔ)之功效。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，共獲得金匱腎氣丸藥物活性成分118個(gè)，通過(guò)數(shù)據(jù)可視化分析獲悉槲皮素、山柰酚、大黃素、薯蕷皂苷元、β-谷甾醇等成分可能是金匱腎氣丸治療OP的關(guān)鍵藥物成分。

研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制破骨細(xì)胞增殖、提高成骨細(xì)胞分化活性、增加血清骨礦含量、改善骨代謝、維持機(jī)體骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡[9]。槲皮素作為一種抗氧化的藥物化學(xué)成分，可以延緩細(xì)胞衰老導(dǎo)致的骨丟失，能夠有效清除衰老的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，hMSCs），并能調(diào)控雌激素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，促進(jìn)hMSCs的增殖、成骨分化，改善骨組織結(jié)構(gòu)及功能[10-12];此外槲皮素還具有免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣的吸收等作用，通過(guò)降低骨組織氧化應(yīng)激參數(shù)，提高骨組織抗感染能力，增強(qiáng)維生素D受體活性，促進(jìn)小腸對(duì)鈣的吸收，調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)基因的表達(dá)[13]。Sharma等[14]證實(shí)山柰酚具有提高成骨參數(shù)，促進(jìn)成骨分化的作用，其機(jī)制是通過(guò)雌激素信號(hào)通路和對(duì)SaOS-2細(xì)胞的刺激反應(yīng)激活WNT信號(hào)通路，提高WNT靶向成骨基因表達(dá)，提高堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、成骨蛋白、骨涎蛋白、骨橋蛋白等蛋白的mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)其增值，提高成骨參數(shù)，促進(jìn)成骨分化。Wong等[15]研究表明，山柰酚能有效地調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的自噬作用，可以明顯地減輕氧化應(yīng)激所致的骨損傷及骨流失，維持了骨吸收與骨代謝之間的動(dòng)態(tài)平衡，并通過(guò)抑制促凋亡基因相關(guān)蛋白的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)水平，具有促進(jìn)成骨的作用。炎癥是骨質(zhì)流失的重要原因，腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）等炎癥介質(zhì)不僅會(huì)直接促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖和骨吸收作用的增強(qiáng)，而且通過(guò)正反饋?zhàn)饔么龠M(jìn)骨吸收細(xì)胞因子（例如IL-6、MCP-1）的產(chǎn)生，進(jìn)一步加劇了骨流失[16]。山柰酚通過(guò)調(diào)控核因子κB信號(hào)通路的激活，降低TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，增強(qiáng)了抗炎細(xì)胞因子（例如IL-10）的表達(dá)，并且通過(guò)對(duì)MAPK機(jī)制的抑制，可以逆轉(zhuǎn)白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1 Beta，IL-1β）介導(dǎo)的骨損傷[17]。Zhao等[18]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元通過(guò)提高機(jī)體雌二醇水平，抑制骨高周轉(zhuǎn)率，可以減少骨量丟失，減緩OP的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)OP具有預(yù)防作用。骨保護(hù)素（Osteoprotegerin，OPG）和核因子κB配體的受體激動(dòng)劑（例如RANKL）在破骨細(xì)胞形成過(guò)程中起重要作用，二者之間的比值是評(píng)估破骨細(xì)胞刺激度的重要指標(biāo)[19]。Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)薯蕷皂苷元治療的大鼠脛骨中RANKL的水平較治療前降低，而OPG的水平明顯升高，二者之間的比值顯著下降，從而降低了對(duì)破骨細(xì)胞的刺激度，減少了骨吸收，對(duì)骨組織具有明顯的保護(hù)作用。雌激素對(duì)全身骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用，是維持骨代謝動(dòng)態(tài)平衡的重要物質(zhì)，是臨床上治療OP的重要藥物，β-谷甾醇是具有雌激素活性的植物雌激素類物質(zhì)。研究表明，卵巢顆粒細(xì)胞是成骨細(xì)胞的重要作用靶點(diǎn)，β-谷甾醇可以誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌二醇E2，使其與成骨細(xì)胞膜上雌激素受體ER結(jié)合，促進(jìn)成骨，改善骨代謝[21]。此外，β-谷甾醇還可以抑制過(guò)氧化物酶、TNF-ɑ、IL-1β等炎癥介質(zhì)的活性，通過(guò)其抗炎作用，減輕炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的骨損傷[22]。TNF-α與RANKL具有協(xié)同作用刺激破骨細(xì)胞的形成，研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以抑制TNF-α的表達(dá)，通過(guò)其抗炎作用減少破骨細(xì)胞的形成，減少骨質(zhì)流失[23]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，大黃素能夠顯著提高大鼠成骨細(xì)胞成活率，改善骨小梁微結(jié)構(gòu)和骨骼力學(xué)性能，抑制血清骨鈣素的升高，增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞的分化和礦化，具有促進(jìn)成骨及骨保護(hù)作用[24]。

通過(guò)藥物-疾病作用靶點(diǎn)富集分析結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸治療OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?yàn)镻TGS2、JUN、ICAM1、IL1B、MMP9等。前列腺素內(nèi)環(huán)氧化合物合成酶2（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2，PTGS2）是前列腺素合成的限速酶，對(duì)機(jī)體的骨代謝具有雙向調(diào)節(jié)作用，一方面介導(dǎo)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞成熟過(guò)程，通過(guò)抑制PTGS2的表達(dá)可以減少OP患者的骨破壞及炎癥反應(yīng);另一方面通過(guò)抑制前列腺素的產(chǎn)生，減少了前列腺素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Macrophage Colony Stimulating Factor，M-CSF）及破骨細(xì)胞分化因子（Receptor Activator Ofnuclear Factor Kappa-B Ligand，RANKL）的產(chǎn)生，減緩破骨細(xì)胞分化及骨吸收作用[25-26]。JUN屬于AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族，是JAK-STAT信號(hào)通路上的快速反應(yīng)基因，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的作用[27];此外，Lerbs等[28]通過(guò)動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，JUN通過(guò)上調(diào)骨祖細(xì)胞相關(guān)基因（例如Shh、Sufu）的表達(dá)，誘導(dǎo)骨祖細(xì)胞增殖、分化，可以補(bǔ)償骨缺損部位的骨量減少并促進(jìn)其骨鈣化組織形成，加速骨折愈合。細(xì)胞間黏附分子1（Intercellular Adhesion Molecule 1，ICAM1）基因具有多態(tài)性，是絕經(jīng)后婦女患OP的易感基因[29]。研究發(fā)現(xiàn)，ICAM1是破骨細(xì)胞分化的重要調(diào)控蛋白，對(duì)破骨細(xì)胞的分化成熟及功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，其介導(dǎo)的黏附作用是破骨細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵條件[30];此外，ICAM1也介導(dǎo)了炎癥細(xì)胞因子向局部病灶位置的黏附和運(yùn)動(dòng)[31]。IL-1β對(duì)破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的活性具有重要的影響，通過(guò)對(duì)IL-1β的抑制，可以降低機(jī)體的骨轉(zhuǎn)換;此外IL-1β對(duì)骨微血管的數(shù)量及其長(zhǎng)度也具有深刻的影響，當(dāng)IL-1β被抑制時(shí)骨組織中微血管的數(shù)量及長(zhǎng)度均降低[32]?；|(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix Metallopeptidase 9，MMP9）主要由破骨細(xì)胞在體內(nèi)選擇性表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)到切割組蛋白HSK18-Q19核室，促進(jìn)破骨細(xì)胞基因的活化，介導(dǎo)了破骨細(xì)胞的骨吸收及Ⅰ型膠原的溶解作用，因此，使用siRNA靶向抑制MMP9可以減少骨吸收，具有骨保護(hù)作用[33]。

通過(guò)對(duì)金匱腎氣丸治療OP的作用靶點(diǎn)，進(jìn)行KEGG富集分析并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、催乳激素信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路是金匱腎氣丸治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵通路。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）在OP的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的影響，是RA患者主要的關(guān)節(jié)外并發(fā)癥之一，其機(jī)制是活動(dòng)性RA導(dǎo)致機(jī)體炎性破骨細(xì)胞骨吸收增強(qiáng)導(dǎo)致RA患者局部骨破壞（骨侵蝕）及全身性骨丟失，因此通過(guò)控制RA患者炎癥反應(yīng)，可以減少骨質(zhì)流失并降低骨折風(fēng)險(xiǎn)[34]。鐵調(diào)素是機(jī)體鐵代謝和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑，受炎癥介質(zhì)（例如IL-1、IL-6、TNF）的調(diào)節(jié)。在最新的RA患者血清鐵調(diào)素水平與骨質(zhì)疏松程度相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，RA處于活動(dòng)期時(shí)由于炎癥介質(zhì)的表達(dá)，鐵調(diào)素產(chǎn)生增加，鐵蛋白水平升高，是絕經(jīng)期婦女和中年男性進(jìn)行性骨丟失的危險(xiǎn)因素，因此，鐵調(diào)素有望成分OP治療的新靶點(diǎn)[35]。催乳激素（Prolactin，PRL）信號(hào)通路對(duì)全身骨代謝具有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，PRL通過(guò)經(jīng)典的STAT3信號(hào)通路可以減緩關(guān)節(jié)炎性癥狀，抑制關(guān)節(jié)血管翳形成及骨破壞，增加小梁面積，降低破骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA水平，下調(diào)Cyt誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，具有骨保護(hù)作用[36]。甲狀腺激素是人體生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素，在骨骼的代謝過(guò)程中有著十分重要的作用。甲亢患者甲狀腺功能代謝的紊亂，會(huì)引起骨代謝障礙及骨量的減少，最終導(dǎo)致OP[37]。研究發(fā)現(xiàn)，T3激活甲狀腺激素受體ɑ（Thyroid Hormone Receptor ɑ，TRɑ），后者在骨骼中呈高表達(dá)，在骨骼及軟骨中介導(dǎo)T3通過(guò)破骨細(xì)胞活性激活劑白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）直接參與了破骨細(xì)胞的骨吸收[38]。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)了細(xì)胞的增殖、分化等過(guò)程，對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞增殖、分化具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路參與了MSCs的成骨分化和遷移，并介導(dǎo)了成骨細(xì)胞增殖與抗凋亡，激活p38/MAPK可以提高成骨細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)成骨，增加骨量[39-40]。

綜上所述，金匱腎氣丸治療OP主要是通過(guò)槲皮素、山柰酚、大黃素、薯蕷皂苷元、β-谷甾醇等活性成分作用于PTGS2、JUN、ICAM1、IL1B、MMP9等關(guān)鍵靶點(diǎn)基因通過(guò)抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、抑制破骨細(xì)胞骨吸收等作用機(jī)制最終達(dá)到治療OP的作用。但是，此次研究尚存在不足之處，需要后期進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]Wang C，Meng H，Wang X，et al.Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Osteoblasts and Adipocytes and its Role in Treatment of Osteoporosis[J].Med Sci Monit，2016，21（22）：226-233.

[2]李沖，呂偉華，王亭亭，等.1088例醫(yī)務(wù)人員骨質(zhì)疏松的流行病學(xué)研究[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2015，21（10）：1217-1220.

[3]Yin X，Zhou C，Li J，et al.Autophagy in bone homeostasis and the onset of osteoporosis[J].Bone Res，2019，3（7）：28-43.

[4]Shah SK，Taufiq I，Najjad MK，et al.Vitamin D deficiency and possible link with Bony pain and onset of Osteoporosis[J].J Pak Med Assoc，2014，64（12 Suppl 2）：S100-103.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)雜志社，中華醫(yī)學(xué)會(huì)全科醫(yī)學(xué)分會(huì)，等.原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥基層診療指南（2019年）[J].中華全科醫(yī)師雜志，2020，19（4）：304-315.

[6]元唯安.中藥新藥研發(fā)關(guān)鍵問(wèn)題思考——以骨質(zhì)疏松癥為例[J].中國(guó)新藥雜志，2020，29（16）：1836-1840.

[7]中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì).絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（骨痿）中醫(yī)藥診療指南（2019年版）[J].中醫(yī)正骨，2020，32（2）：1-13.

[8]安玉蘭，曹昌霞，田玉梅，等.金匱腎氣丸合補(bǔ)中益氣湯加減治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效及對(duì)免疫炎癥因子的調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2021，27（6）：69-75.

[9]Hayashi T，Ina K，Maeda M，et al.The effects of selective estrogen receptor modulator treatment following hormone replacement therapy on elderly postmenopausal women with osteoporosis[J].Nitric Oxide，2011，24（4）：199-203.

[10]Farr JN，Xu M，Weivoda MM，et al.Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice[J].Nat Med，2017，23（9）：1072-1079.

[11]Yuan Z，Min J，Zhao Y，et al.Quercetin rescued TNF-alpha-induced impairments in bone marrow-derived mesenchymal stem cell osteogenesis and improved osteoporosis in rats[J].Am J Transl Res，2018，10（12）：4313-4321.

[12]Pang XG，Cong Y，Bao NR，et al.Quercetin Stimulates Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Differentiation through an Estrogen Receptor-Mediated Pathway[J].Biomed Res Int，2018，2018：4178021.

[13]Nada Orsolic，Zeljko Jelec，Johann Nemrava，et al.Effect of Quercetin on Bone Mineral Status and Markers of Bone Turnover in Retinoic Acid-Induced Osteoporosis[J].Polish Journal of Food and Nutrition Sciences，2018，68（2）：149-162.

[14]Sharma AR，Nam JS.Kaempferol stimulates WNT/β-catenin signaling pathway to induce differentiation of osteoblasts[J].J Nutr Biochem，2019，74：108228.

[15]Wong SK，Chin KY，Ima-Nirwana S.The Osteoprotective Effects Of Kaempferol：The Evidence From In Vivo And In Vitro Studies[J].Drug Des Devel Ther，2019，13：3497-3514.

[16]Seong S，Kim JH，Kim N.Pro-inflammatory cytokines modulating osteoclast differentiation and function[J].J Rheum Dis，2016，23：148-153.

[17]Pang JL，Ricupero DA，Huang S，et al.Differential activity of kaempferol and quercetin in attenuating tumor necrosis factor receptor family signaling in bone cells[J].Biochem Pharmacol，2006，71（6）：818-26.

[18]Zhao S，Niu F，Xu CY，et al.Diosgenin prevents bone loss on retinoic acid-induced osteoporosis in rats[J].Ir J Med Sci，2016，185（3）：581-587.

[19]Tanaka H，Mine T，Ogasa H，et al.Expression of RANKL/OPG during bone remodeling in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，411（4）：690-4.

[20]Zhang Z，Song C，F(xiàn)u X，et al.High-dose diosgenin reduces bone loss in ovariectomized rats via attenuation of the RANKL/OPG ratio[J].Int J Mol Sci，2014，15（9）：17130-47.

[21]曾莉萍，徐賢柱，饒華，等.杜仲葉β-谷甾醇對(duì)成骨細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（5）：1051-1053.

[22]Liz R，Zanatta L，dos Reis GO，et al.Acute effect of β-sitosterol on calcium uptake mediates anti-inflammatory effect in murine activated neutrophils[J].J Pharm Pharmacol，2013，65（1）：115-22.

[23]Luo JS，Zhao X，Yang Y.Effects of emodin on inflammatory bowel disease-related osteoporosis[J].Biosci Rep，2020，40（1）：BSR20192317.

[24]Chen X，Zhang S，Chen X，et al.Emodin promotes the osteogenesis of MC3T3-E1 cells via BMP-9/Smad pathway and exerts a preventive effect in ovariectomized rats[J].Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2017，49（10）：867-878.

[25]Liu WJ，Jiang ZM，Chen Y，et al.Network pharmacology approach to elucidate possible action mechanisms of Sinomenii Caulis for treating osteoporosis[J].J Ethnopharmacol，2020，257：112871.

[26]Wong RW，Rabie AB.Effect of quercetin on bone formation[J].J Orthop Res，2008，26（8）：1061-6.

[27]謝麗華，陳娟，李生強(qiáng)，等.六味地黃丸對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證JAK/STAT信號(hào)通路基因的影響[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2014，20（7）：741-746.

[28]Lerbs T，Cui L，Muscat C，et al.Expansion of Bone Precursors through Jun as a Novel Treatment for Osteoporosis-Associated Fractures[J].Stem Cell Reports，2020，14（4）：603-613.

[29]Yamada Y，Ando F，Shimokata H.Association of candidate gene polymorphisms with bone mineral density in community-dwelling Japanese women and men[J].Int J Mol Med，2007，19（5）：791-801.

[30]王軍，趙志河，羅頌椒，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)分化過(guò)程中破骨細(xì)胞分化因子和細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)變化[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，23（3）：240-243.

[31]Wang L，Li XH，Ning WC.Evaluation of ICAM-1 and VCAM-1 Gene Polymorphisms in Patients with Periodontal Disease[J].Med Sci Monit，2016，22：2386-91.

[32]Tulotta C，Lefley DV，F(xiàn)reeman K，et al.Endogenous Production of IL1B by Breast Cancer Cells Drives Metastasis and Colonization of the Bone Microenvironment[J].Clin Cancer Res，2019，25（9）：2769-2782.

[33]Zhu L，Tang Y，Li XY，et al.Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases[J].Sci Transl Med，2020，12（529）.

[34]Raterman HG，Bultink IE，Lems WF.Osteoporosis in patients with rheumatoid arthritis：an update in epidemiology，pathogenesis，and fracture prevention[J].Expert Opin Pharmacother，2020，21（14）：1725-1737.

[35]Sato H，Takai C，Kazama JJ，et al.Serum hepcidin level，iron metabolism and osteoporosis in patients with rheumatoid arthritis[J].Sci Rep，2020，10（1）：9882.

[36]Ledesma-Colunga MG，Adán N，Ortiz G，et al.Prolactin blocks the expression of receptor activator of nuclear factor κB ligand and reduces osteoclastogenesis and bone loss in murine inflammatory arthritis[J].Arthritis Res Ther，2017，19（1）：93.

[37]Yin WL，You XY.Vitamin D receptor gene polymorphism in hyperthyroidism patients with osteoporosis[J].Chin J Exp Surg，2017，34（8）：1414-1415.

[38]Delitala AP，Scuteri A，Doria C.Thyroid Hormone Diseases and Osteoporosis[J].J Clin Med，2020，9（4）：1034-1051.

[39]Jiang K，Teng GD，Chen YQ.MicroRNA-23 suppresses osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells by targeting the MEF2C-mediated MAPK signaling pathway[J].J Gene Med，2020，22（10）：e3216.

[40]Yu H，Jiang L，Wan B，et al.The role of aryl hydrocarbon receptor in bone remodeling[J].Prog Biophys Mol Biol，2018，134：44-49.

（2020-11-13收稿?責(zé)任編輯：魏慶雙）