血清HBV pgRNA與HBV cccDNA的關(guān)系及其臨床意義研究進(jìn)展

張?jiān)婄?，喻雪琴，陳芳，陳星，戢敏，梅小?/p>

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充637000

以乙肝病毒(HBV)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)為模板進(jìn)行HBV RNA逆轉(zhuǎn)錄是HBV復(fù)制的初始環(huán)節(jié)，HBV cccDNA的存在是HBV持續(xù)感染的標(biāo)志[1,2]。目前，即使患者血清中HBV DNA、乙肝表面抗原(HBsAg)消失或發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換，但肝細(xì)胞核中仍存在HBV cccDNA而無(wú)法被藥物清除，肝細(xì)胞核內(nèi)少量HBV cccDNA即可導(dǎo)致HBV相關(guān)性肝病患者病情復(fù)發(fā)。由于HBV cccDNA存在于肝細(xì)胞內(nèi)，需要進(jìn)行創(chuàng)傷性肝穿刺活組織檢測(cè)，且HBV cccDNA在肝內(nèi)呈不均勻分布，因此HBV cccDNA的精準(zhǔn)檢測(cè)難以在臨床中廣泛開展，臨床上亟需尋找新的血清標(biāo)志物來(lái)準(zhǔn)確反映肝組織中HBV cccDNA的表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)錄程度。2018版歐洲肝病學(xué)會(huì)《慢性乙型肝炎病毒感染管理臨床實(shí)踐指南》及2019版《慢性乙型肝炎防治指南》中均增加了3種新型HBV檢測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物，其中包括血清HBV前基因組(HBV pgRNA)[3]。但目前血清HBV pgRNA檢測(cè)并未在臨床推廣應(yīng)用，可能與其在血清中表達(dá)較低、相關(guān)研究數(shù)據(jù)少及尚未形成統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)等有關(guān)[4]。本文就血清HBV pgRNA與HBV cccDNA的關(guān)系及其臨床意義作一綜述。

1 血清HBV pgRNA與HBV cccDNA的關(guān)系

1.1 血清HBV pgRNA概述 德國(guó)學(xué)者Kock等[5]在1996年從CHB患者血清中首次檢出了HBVRNA，隨后HBV RNA迅速成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，關(guān)于HBV RNA的相關(guān)報(bào)道不斷出現(xiàn)。Tanaka等[6]利用蔗糖梯度離心法發(fā)現(xiàn)，HBV RNA與HBcAg、HBV DNA結(jié)構(gòu)類似，并明確指出HBV RNA為乙肝病毒顆粒的核心成分。Wang等[7]利用免疫印跡技術(shù)排除相關(guān)干擾因素，發(fā)現(xiàn)在11例進(jìn)行核苷(酸)類(NAs)藥物初治的CHB患者血清中存在HBV RNA，是一種長(zhǎng)度為3.5 kb的RNA；隨后研究人員利用引物擴(kuò)增及多重PCR技術(shù)，對(duì)接受NAs藥物處理的HepAD38和HepG2.2.15細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)CHB患者血清中長(zhǎng)度為3.5 kb的RNA就是HBV pgRNA。

以HBV cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄出的HBV pgRNA在逆轉(zhuǎn)錄過程中會(huì)被降解，血清中HBV pgRNA的存在可能是因?yàn)镹As藥物抑制了其逆轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致血清中HBV pgRNA累積而表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn)，血清HBV pgRNA可能是肝細(xì)胞中的pgRNA在開始逆轉(zhuǎn)錄之前直接獲得包膜，并從肝細(xì)胞中釋放入血所致，因該病毒顆粒中含有HBV RNA，又稱之為“HBV RNA病毒樣顆?！盵8]。郭濛濛[9]對(duì)Nas治療前后CHB患者血清HBV RNA水平進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，患者治療后血清HBV RNA水平升高，并推測(cè)血清中存在的HBV pgRNA是由肝細(xì)胞核中的HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)。

1.2 血清HBV pgRNA與HBV cccDNA的相互關(guān)系 HBV感染人體后即侵入正常肝細(xì)胞，隨后HBV DNA脫去核殼成為松弛環(huán)狀雙鏈DNA(rcDNA)[10]。rcDNA是由正負(fù)兩條鏈組成，負(fù)鏈中由幾個(gè)堿基形成“缺口”，rcDNA進(jìn)入肝細(xì)胞核后，在依賴HBV編碼的DNA聚合酶作用下填補(bǔ)缺口，進(jìn)行折疊、扭轉(zhuǎn)等過程，成為超螺旋結(jié)構(gòu)的HBV cccDNA[11]；同時(shí)細(xì)胞以HBV cccDNA為模板，轉(zhuǎn)錄出3.5、2.4、2.1、0.7 kb四種不同長(zhǎng)度的mRNA，再合成多種病毒蛋白[11]。3.5 kb長(zhǎng)的RNA有兩種表達(dá)模式，一種為可編碼乙肝e抗原(HBeAg)相關(guān)蛋白的pre-C mRNA，另一種為逆轉(zhuǎn)錄模板的pgRNA；該RNA可利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成rcDNA中的負(fù)鏈，再以此為模板，在DNA聚合酶介導(dǎo)下合成正鏈DNA，正、負(fù)鏈DNA重新組合成為新的HBV rcDNA。新的HBV rcDNA一部分再入肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)化成為新的HBV cccDNA，另一部分與病毒蛋白重新組裝釋放到肝細(xì)胞外，成為有完整病毒顆粒的HBV DNA，再感染新的正常肝細(xì)胞[12,13]。因此，HBV pgRNA是HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以病毒顆粒形式表達(dá)于HBV相關(guān)性肝病患者的血清中。

2 血清HBV pgRNA檢測(cè)的臨床意義

2.1 反映HBV cccDNA的存在狀態(tài) HBV pgRNA在逆轉(zhuǎn)錄之前獲得包膜，在感染肝細(xì)胞中以病毒顆粒方式釋放入血。與HBsAg的多個(gè)來(lái)源不同，血清中HBV pgRNA的惟一來(lái)源是HBV cccDNA，每個(gè)感染HBV的肝細(xì)胞內(nèi)均存在一定量HBV cccDNA，是HBV pgRNA的惟一轉(zhuǎn)錄模板。從理論上講，血清HBV pgRNA水平可反映肝細(xì)胞HBV cccDNA水平及其轉(zhuǎn)錄活性，且血清HBV pgRNA檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行、操作性強(qiáng)、患者易接受，是反映HBV cccDNA水平較為可靠的指標(biāo)[2]。

自1998年應(yīng)用NAs進(jìn)行抗HBV治療以來(lái)，臨床上就存在患者抗HBV治療停藥后HBV復(fù)發(fā)率高的問題，抗HBV治療還可引起酪氨酸-甲硫氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(YMDD)變異。郭濛濛[9]在找尋YMDD變異預(yù)測(cè)標(biāo)志物時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生YMDD的患者體內(nèi)HBV pgRNA表達(dá)升高；表明血清HBV pgRNA高表達(dá)可能是HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄形式及HBV RNA肝內(nèi)組裝的標(biāo)志，即檢測(cè)血清HBV pgRNA表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)YMDD發(fā)生有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。李惠姣[14]通過建立體外TDF抗病毒細(xì)胞模型，并觀察細(xì)胞上清液HBV pgRNA、HBV DNA、HBsAg與細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的關(guān)系；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞上清液HBV pgRNA水平與HBV cccDNA呈顯著正相關(guān)關(guān)系，且HBV DNA、HBsAg水平反映HBV cccDNA水平及復(fù)制轉(zhuǎn)錄的敏感度均明顯低于HBV pgRNA。有報(bào)道指出，CHB患者肝組織HBV pgRNA與HBV cccDNA水平可反映患者體內(nèi)HBV的復(fù)制水平，隱匿性HBV感染者HBV pgRNA與HBV cccDNA水平明顯低于HBsAg陽(yáng)性患者，表明HBV pgRNA與HBV cccDNA對(duì)HBV感染者體內(nèi)HBV活躍程度的預(yù)測(cè)價(jià)值均高于HBsAg[15]。Lu等[16]對(duì)33例結(jié)束抗HBV治療后的CHB患者進(jìn)行血清檢測(cè)，結(jié)果顯示所有患者血清HBV DNA為陰性或低于檢測(cè)下限，但仍有21例在隨訪24周后檢出血清HBV pgRNA且均發(fā)生了病毒學(xué)復(fù)發(fā)；提示即使CHB患者血清中檢測(cè)不到HBV pgRNA也不能表示肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA消失或停止轉(zhuǎn)錄，但檢測(cè)不到HBV pgRNA可使患者停藥后的復(fù)發(fā)率大大降低。因此，對(duì)于慢性HBV感染者經(jīng)過抗HBV治療HBV DNA陰轉(zhuǎn)之后的病情評(píng)估、療效判斷、停藥時(shí)機(jī)選擇及是否發(fā)生YMDD變異等，血清HBV pgRNA水平檢測(cè)均具有非常重要的指導(dǎo)作用。

2.2 預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換 研究發(fā)現(xiàn)，在CHB患者接受NAs治療的過程中，HBV DNA下降到低水平時(shí)，HBeAg陽(yáng)性者HBV pgRNA檢出率高于HBeAg陰性者；這可能與HBeAg陽(yáng)性者肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA較為活躍有關(guān)，即血清HBV pgRNA水平可反映患者體內(nèi)HBV的復(fù)制狀態(tài)，HBeAg是影響血清HBV pgRNA水平的因素之一[19]。Berg等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在采用阿德福韋酯進(jìn)行抗HBV治療的17例患者中，11例HBeAg陽(yáng)性患者中有5例出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換，且與未發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者相比，發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換者血清HBV RNA水平明顯降低；該研究認(rèn)為，血清HBV pgRNA可能成為預(yù)測(cè)HBeAg血清轉(zhuǎn)換的指標(biāo)之一，與Huang等[21]的研究結(jié)果類似。彭亞夢(mèng)等[22]在HBeAg陽(yáng)性患者血清中發(fā)現(xiàn)HBV pgRNA與HBeAg具有顯著相關(guān)性，但在HBeAg陰性患者血清中并未發(fā)現(xiàn)此種相關(guān)性；提示HBeAg不僅可以從HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)，還可由整合的HBV DNA產(chǎn)生。因此，HBeAg在反映患者療效上有一定缺陷，而HBV pgRNA能直接準(zhǔn)確地反映患者抗HBV治療的近遠(yuǎn)期療效。

2.3 反映乙肝核心相關(guān)抗原(HBcrAg)表達(dá)水平 HBcrAg是近年發(fā)現(xiàn)的HBV感染的新型血清檢測(cè)標(biāo)志物之一，是由前C基因及C基因編碼的HBcAg、HBeAg、p22cr組成的組合性標(biāo)志物，這3種蛋白質(zhì)共擁有149個(gè)氨基酸序列長(zhǎng)度，對(duì)于預(yù)測(cè)HBV感染者抗HBV治療的療效及選擇停藥時(shí)機(jī)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。Seto等[23]研究發(fā)現(xiàn)，HBcrAg可反映肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的水平及活躍程度，同時(shí)與血清HBV DNA及肝細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)高于HBsAg與HBV cccDNA之間的相關(guān)系數(shù)；表明作為HBV cccDNA的替代檢測(cè)標(biāo)志物，HBcrAg較HBsAg具有更高的價(jià)值。對(duì)HBsAg陰性的乙肝病毒攜帶者進(jìn)行免疫抑制劑治療時(shí)，患者發(fā)生HBV再活躍的重要因素就是血清HBcrAg陽(yáng)性；提示HBcrAg可能成為患者接受預(yù)防性抗HBV治療的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)對(duì)患者抗HBV治療后監(jiān)測(cè)停藥后HBV再?gòu)?fù)制的風(fēng)險(xiǎn)具有較高預(yù)測(cè)價(jià)值[24,25]。研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者經(jīng)NAs抗HBV治療后，HBcrAg陽(yáng)性者血清HBV pgRNA、HBV cccDNA及HBV DNA復(fù)制水平均明顯高于陰性者，提示HBV pgRNA可在一定程度上反映HBcrAg表達(dá)情況[26]。血清HBV pgRNA、HBcrAg均可作為反映HBV cccDNA水平的無(wú)創(chuàng)性代替血清學(xué)指標(biāo)，相比之下，HBV pgRNA來(lái)源惟一，是HBV cccDNA的直接產(chǎn)物，其準(zhǔn)確性比HBcrAg更高。

2.4 反映HBV DNA、HBsAg水平變化 HBV DNA、HBsAg是目前診斷HBV感染最基本的血清學(xué)指標(biāo)，有助于評(píng)估患者病情狀況、預(yù)測(cè)抗HBV療效、預(yù)測(cè)抗HBV應(yīng)答程度和選擇停藥時(shí)機(jī)等。研究發(fā)現(xiàn)，血清HBV DNA及HBsAg可作為反映HBV cccDNA水平的無(wú)創(chuàng)替代血清學(xué)指標(biāo)之一[27]。臨床上CHB患者血清中HBV DNA消失或低于檢測(cè)值下限后經(jīng)鞏固抗HBV治療，其停藥后復(fù)發(fā)率仍較高，這可能與肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA沒有被完全清除有關(guān)。HBV DNA是由HBV pgRNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)，而HBV pgRNA由HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)，即HBV DNA水平同時(shí)受到HBV pgRNA、HBV cccDNA水平的影響。NAs抗HBV治療只作用于HBV的逆轉(zhuǎn)錄過程，可阻斷HBV pgRNA逆轉(zhuǎn)錄，使HBV DNA合成受到抑制，但HBV cccDNA仍可以HBV RNA病毒樣顆粒模式合成新的HBV顆粒。因此，NAs抑制CHB患者HBV pgRNA逆轉(zhuǎn)錄后，其血清HBV DNA水平下降，但HBV cccDNA下降緩慢，在HBV DNA低于檢測(cè)值下限時(shí)，HBV cccDNA仍可能存在陽(yáng)性表達(dá)[14]。

目前已有的抗HBV治療方法尚達(dá)不到完全治愈的治療目標(biāo)，只能達(dá)到功能性治愈，即血清中檢測(cè)不到HBV DNA、HBsAg，和(或)發(fā)生HBsAg血清轉(zhuǎn)換。HBsAg主要是由HBV cccDNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄后合成2.4、2.1 kb的mRNA翻譯出來(lái)的病毒蛋白，抗HBV治療并不能直接對(duì)其翻譯過程產(chǎn)生阻斷作用，因此患者血清HBsAg水平下降十分緩慢。Giersch等[28]研究顯示，接受NAs治療的患者血清中低水平的HBsAg還可能來(lái)源于HBV DNA。研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg的來(lái)源不僅是HBV cccDNA，也可由整合的HBV DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)[29]。由于肝細(xì)胞更新周期長(zhǎng)，導(dǎo)致來(lái)源于整合HBV DNA的HBsAg表達(dá)非常穩(wěn)定，這導(dǎo)致了HBsAg用于反映HBV cccDNA水平和治療效果的準(zhǔn)確性較低。

2.5 預(yù)測(cè)抗HBV治療療效 肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA存在是HBV持續(xù)或反復(fù)感染的最關(guān)鍵因素，肝細(xì)胞內(nèi)低水平的HBV cccDNA是患者接受治療后HBV復(fù)發(fā)的關(guān)鍵點(diǎn)。血清HBV pgRNA的唯一來(lái)源僅為HBV cccDNA，可作為HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、替代反映肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA水平及HBV活躍程度的良好指標(biāo)，對(duì)于評(píng)價(jià)抗HBV療效、藥物應(yīng)答程度、停藥時(shí)機(jī)選擇、HBV基因突變與耐藥及預(yù)測(cè)停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、肝細(xì)胞癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)均具有較高價(jià)值。血清HBV pgRNA指標(biāo)可反映肝組織病原學(xué)狀態(tài)，創(chuàng)傷性小，患者接受程度高。

綜上所述，新型血清標(biāo)志物HBV pgRNA可反映HBV cccDNA的存在狀態(tài)、預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、反映HBcrAg表達(dá)水平、反映HBV DNA、HBsAg水平變化、預(yù)測(cè)抗HBV治療療效等，在反映CHB患者病情、評(píng)估療效、選擇停藥時(shí)機(jī)及預(yù)測(cè)停藥后疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)等方面均具有較高的臨床價(jià)值。但目前HBV pgRNA檢測(cè)技術(shù)尚未完全成熟，仍處于大量研究階段，且存在許多問題尚待解決，如HBV pgRNA是否能準(zhǔn)確地反映HBV cccDNA的存在狀態(tài)，HBV pgRNA作為停藥指標(biāo)的價(jià)值是否優(yōu)于HBsAg等。未來(lái)利用逆轉(zhuǎn)錄PCR法對(duì)HBV pgRNA檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行完善，再將其與HBsAg、HBcAg、HBcrAg、HBV DNA等指標(biāo)結(jié)合，對(duì)CHB患者的綜合評(píng)價(jià)體系將更加完善。